научная статья по теме МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ФИЗИОЛОГИИ МОЗГА – ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ НЕЙРОГЕНОМИКА Биология

Текст научной статьи на тему «МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ФИЗИОЛОГИИ МОЗГА – ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ НЕЙРОГЕНОМИКА»

УСПЕХИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК, 2007, том 38, № 1, с. 3-13

УДК 577.25

МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА МОЛЕКУЛЯРИО-ГЕИЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ФИЗИОЛОГИИ МОЗГА - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ НЕЙРОГЕНОМИКА

© 2007 г. Н. Н. Дыгало

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Более трети всех генов млекопитающих связано с формированием мозга и обеспечением его функций. Для выяснения значения гена, интересующего исследователя, в деятельности центральной нервной системы и возможного использования этого гена или кодируемого им белка в качестве мишени для терапевтического воздействия широко применяются методы постранскрипционного ген-сайленсинга, такие как антисенс-технология и РНК-интерференция. Возможности этих методов проиллюстрированы анализом участия альфа2А-адренорецепторов мозга в формировании и осуществлении нормальных, а также патологических форм поведения. Эти методы впервые позволили обнаружить "программирование" нейрогеном в критический период развития мозга последующих психофизиологических свойств индивида. Целенаправленное изменение экспрессии генов открывает новые возможности изучения функции центральной нервной системы и применения РНК-интерференции для воздействия на патологические процессы в головном мозге.

Мозг - наиболее сложно организованная часть организма млекопитающих. Он состоит из миллиардов нервных клеток различных типов, объединенных синаптическими контактами в преци-зионно организованные сети. Многочисленные разветвленные и точно адресованные связи нервных клеток обеспечивают физиологические и поведенческие функции, включая восприятие информации, обучение, память и реагирование на внешние и внутренние стимулы. Морфологически и функционально различные типы нейронов характеризуются специфичной для каждого из них экспрессией белков, участвующих в нейро-трансмиссии и осуществляющих синтез, метаболизм, накопление, высвобождение, обратный захват и рецепцию нейротрансмиттеров. Считается, что от трети до половины всех генов млекопитающих исключительно или в основном связаны с формированием мозга и обеспечением его функций. Наряду с геномными регуляторами активность экспрессии многих этих генов может изменяться под влиянием внутренних и внешних для организма факторов. Особенно ясно это проявляется, например, в зависимой от активности нейрона и повышающейся под ее влиянием экспрессии генов раннего ответа. Сведения последнего времени позволяют предполагать, что длительные патологические или, напротив, нейроадаптивные терапевтические эффекты, являющиеся, как правило, проявлениями нарушенной или нормализованной активности определенных нейронов и их цепей, могут вовлекать в механизм своего формирования не только изменения собственно процесса передачи нервного импульса, но и модуляцию экспрессии специфических генов, кодирующих белки, участвующие в этом процессе. Исследова-

ние неясных в настоящее время функций генов в мозге становится актуальным как для теоретической нейробиологии, так и для поиска практически возможных путей коррекции патологических процессов в центральной нервной системе.

После завершения в основном расшифровки структуры генома человека и ряда других видов стали возможными практические подходы к выяснению молекулярно-генетического обеспечения работы нейронов и их сетей. Ключевым для решения этой проблемы является установление функции генов в мозге, а также влияния уровня их экспрессии на деятельность нервной системы и регулируемые этой системой висцеральные функции и поведение. Основные подходы к решению этой проблемы заимствованы нейронауками из арсенала молекулярной биологии. Для анализа экспрессии нейрогенов в последнее время все шире используются ДНК-микрочипы, полимеразная цепная реакция в реальном времени, а также разнообразные подходы протеомики. С помощью этих методов получена масса информации. Однако в такой сложной системе, как мозг, практически при любой его активности, состоянии или патологическом процессе изменяется экспрессия десятков и сотен генов. Какова функция каждого из них? Какие гены или их белки могут быть перспективными мишенями для терапевтического воздействия? Для получения ответов на эти вопросы, составляющие основные проблемы функциональной нейрогеномики, используют разнообразные методы, способные блокировать экспрессию конкретного гена.

СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА В МОЗГЕ

Методы снижения экспрессии гена можно подразделить на два основных типа. Первый связан с изменением структуры гена (постоянные и условные нокауты), а второй включает разнообразные способы постранскрипционного подавления экспрессии генов (антисенс-технология, рибозимы, РНК-интерференция). У животных-нокаутов создается ситуация нулевой экспрессии гена, как правило, на протяжении всего онтогенеза особи [44]. Такая особенность этих животных налагает ограничения на интерпретацию получаемых на данной модели результатов, наиболее очевидными из которых являются возможности онтогенетической и функциональной компенсации перманентной или длительной, в течение месяцев, нулевой экспрессии гена.

Среди постранскрипционных способов снижения экспрессии гена, интересующего исследователя, наиболее популярны в настоящее время антисенс-технология, основанная на использовании антисмысловых олигонуклеотидов, а также идущая ей на смену и получающая все более широкое распространение РНК-интерференция, базирующаяся на применении коротких двухцепочеч-ных РНК-siRNA (small interfering RNA). Сама возможность сиквенс-специфического подавления экспрессии гена-мишени короткой синтетической интерферирующей РНК в головном мозге млекопитающих in vivo была установлена совсем недавно [19, 20, 53]. Антисенс-технология и РНК-интерференция, вызывающие лишь временное снижение экспрессии гена-мишени, длящееся в зависимости от особенностей воздействия дни или недели, значительно более свободны от наслоения компенсаторных процессов, чем нокауты.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВОЗДЕЙСТВИЙ, НАЦЕЛЕННЫХ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА

Возможность применения антисенс-технологии продемонстрирована почти 30 лет назад [62]. Однако ее распространение, обусловленное успехами химии олигонуклеотидов, началось лишь в 90-х годах прошлого века [55]. Хотя нуклеиновые кислоты не проникают через гемато-энцефали-ческий барьер, олигонуклеотиды могут быть легко введены непосредственно в мозг. Центральная нервная система в отличие от многих органов и плазмы крови имеет сравнительно низкую нукле-азную активность, и введенные модифицированные олигонуклеотиды, например фосфоротио-аты, длительно сохраняя в мозге свою целостность, эффективно подавляют в нем экспрессию генов [28]. В последнее десятилетие эта технология находит применение в исследованиях функции нейрогенов и для коррекции этой функции в

патологических ситуациях [2, 24, 29, 33, 36, 40, 5053, 60]. Снижение уровня мРНК гена-мишени происходит в результате образования антисмысловым олигонуклеотидом и участком мРНК-ми-шени комплементарного дуплекса, который затем разрушается РНКазой Н. Следствием этого, а также непосредственной помехи дуплекса трансляционному механизму теоретически должно быть снижение количества белка-продукта гена-мишени. Однако на практике лишь небольшая часть из синтезируемых олигонуклеотидов эффективно подавляет экспрессию гена-мишени [55]. Методология выбора структуры эффективного антисенса опирается не только на поиск уникальной в транскриптоме последовательности, на которую антисенс должен быть нацелен, но и должна учитывать пространственную укладку мРНК-мишени [44, 55]. Потенциальная эффективность антисмыслового олигонуклеотида проверяется, как правило, in vitro.

Сопоставление in vivo эффектов разных антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на близкие и даже перекрывающиеся участки транскрипта одного и того же гена оказалось возможным, например, для альфа2Л-адренорецепторов головного мозга. Стимуляторы этих рецепторов применяют для снижения артериального давления, при анестезии в медицинской и ветеринарной хирургии, а их блокаторы предлагаются для лечения мужской импотенции, депрессии, шизофрении, болезней Алцгеймера и Паркинсона [4, 6, 34]. Эти рецепторы принадлежат к мультигенному семейству, отдельные члены которого не различаются средствами традиционной фармакологии [4, 6, 34], что стимулировало применение антисенс-технологии для их исследования. В литературе опубликованы биологические эффекты трех разных тиофосфатов олигонуклеотидов, комплементарных области, содержащей кодон инициации трансляции, или близкой к этому кодону части транскрипта гена альфа2А-адренорецептора. Первый нацелен на позиции мРНК этого гена от (-11) до (+7) (антисенс-1) [16, 17, 50-53]; второй -от (+1) до (+21) (антисенс-2) [38, 41] и третий - от (+4) до (+21) (антисенс-3) [41-43].

Все три антисенса снижали экспрессию гена-мишени и изменяли поведение животных. Однако дозы каждого из них, вызывающие заметные эффекты, были различными. Антисенс-1 в дозах 0.06-3 нмоля специфически снижал уровень мРНК альфа2А-адренорецептора, а также, в зависимости от дозы, угнетал экспрессию рецеп-торного белка в стволе головного мозга взрослых крыс [16, 50]. 3 нмоля этого антисенса вызывали при введении в течение 3 дней 80% снижение уровня мРНК и почти 2-кратное уменьшение количества рецепторного белка [50]. Инфузия в головной мозг крыс антисенса-2 в течение недели по 24 нмоль в день снижала экспрессию этих ре-

цепторов в прилежащих к месту введения областях мозга на 50-80% от уровня, наблюдаемого при введении контрольного олигонуклеотида [41]. Такая эффективность антисенса-2 в отношении гена-мишени подтверждается и опытами in vitro [38]. В то же время антисенс-3, введенный в мозг в течение недели суммарно в количествах 72-168 нмолей, снизил уровень рецепторного белка только в наиболее близких к месту введения участках мозга не более чем на 20-30% [4143]. Эти результаты свидетельствуют о явно различной способности антисенсов 1 > 2 > 3 снижать экспрессию альфа2Л-адренорецептора в мозге. Нормированная на количество олигонуклеотида эффективность антисенса-1 более чем на порядок превышает таковую антисенса-3.

Биологическая эффективность антисенсов, оцененная по

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»