научная статья по теме МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР Биология

Текст научной статьи на тему «МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР»

= ОБЗОРЫ

581.1:575.1

МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

© 2007 г. С. Ä. Данилова

Институт физиологии растений им К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 11.01.2007 г.

В обзоре анализируются наиболее широко применяемые методы генетической трансформации зерновых культур. Приведены необходимые условия трансформации, регенерации и тестирования злаковых культур. Описан предложенный автором новый подход в использовании Agrobacterium tume-faciens для получения трансгенных растений. Обзор может быть полезен для генных инженеров, биотехнологов и других специалистов, которые получают и изучают трансгенные растения.

Zea mays - Hordeum vulgare - Triticum aestivum - Agrobacterium tumefaciens - незрелые зародыши - эм-бриогенный каллус - регенерация - баллистическая трансфекция - агробактериалъный монослой -трансгенные растения

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 645-658

УДК

ВВЕДЕНИЕ

Развитие генетической инженерии растений открывает перед человечеством большие перспективы. Изменяя геном растений за счет переноса в него чужеродных генов от бактерий, грибов, экзотических растений, животных и даже человека, можно получить растения, которые способны не только противостоять вирусным, бактериальным и грибковым заболеваниям, но также иметь устойчивость к различным неблагоприятным условиям окружающей среды. Однако, следует отметить, что применение генов нерастительного происхождения еще недостаточно изучено и может привести к серьезным проблемам в использовании трансгенных растений для человека и животных. Новая технология за короткий в сравнении с традиционными подходами срок позволяет улучшить как пищевую ценность, так и декоративные качества культурных растений [1-4]. Чтобы снизить стоимость белков медицинского назначения, трансгенные растения начинают использовать в качестве живых биореакторов для их получения [5, 6]. Невозможно переоценить роль трансгенных растений для изучения регуля-

Сокращения: Км - канамицин; ПЦР - полимеразная цепная реакция; bar - ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы; Сх - цефотаксим; EPSP - ген 5-энолпирувилшикимат-3-фос-фатсинтазы; GFP - зеленый флюоресцентный белок; GOX -ген глифосатоксидазы; GUS (uidA) - ген ß-глюкуронидазы; nptII - ген неомицинфосфотрансфераза II; X-Gluc - 5-бром-4-хлор-3-индолил^^-глюкуронид.

Адрес для корреспонденции: Данилова Светлана Алексеевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: svdan@yandex.ru

ции экспрессии генов, что, в конечном счете, приведет к познанию механизмов регуляции роста и развития растений.

Несмотря на огромные возможности использования трансгенных растений, до настоящего времени их получение остается трудной задачей. Имеющиеся в настоящее время методы и подходы к получению трансгенных зерновых растений сложны и низкоэффективны. Кроме того, различные сорта зерновых культур и даже различные экспланты одного сорта часто требуют применения значительно различающихся методов трансформации. Весь процесс получения трансгенных растений можно условно разделить на три этапа: (1) перенос чужеродной ДНК в геном растения; (2) процесс регенерации, который позволяет получить из трансформированного эксплан-та нормальное растение, и (3) отбор трансгенных растений и доказательство их трансгенной природы. Для переноса чужеродных генов в растения зерновых культур используют различные методы прямого и непрямого переноса ДНК, а в качестве эксплантов, в основном, используют морфоген-ный каллус или незрелые зародыши, из которых, после инициации морфогенного каллуса, можно получить целое растение. Однако, многие зерновые культуры имеют невысокий морфогенный потенциал, что ограничивает их широкое использование для генно-инженерных модификаций. Для отбора трансгенных растений применяются широко распространенные в настоящее время селективные гены и среды, специфические ферментативные активности, репортерные гены и различные молекулярно-биологические методы. Задача настоящего обзора состоит в том, чтобы проанализировать общие подходы и методы, ис-

пользуемые для трансформации зерновых культур, отметив их достоинства и недостатки, а также обсудить ряд рекомендаций, которые, возможно, будут способствовать более эффективной трансформации злаков.

МЕТОДЫ ПРЯМОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ

Баллистическая трансформация

Наиболее активно применяемым методом прямого переноса генов является способ генетической трансформации растений с использованием установки под названием дробовик (short gun). Этот метод получил название "бомбардировка частичками" (particle bombardment) или биобаллистическая трансформация (biolistic transformation). Он нашел самое широкое применение именно для трансформации зерновых культур. Суть метода заключается в том, что на частички химически инертного металла (вольфрама, золота или платины) осаждается ДНК, а затем они разгоняются в установке с использованием электрического заряда или давления газа гелия и направляются в растительные ткани. Частички металла попадают внутрь растительной клетки, доставляя туда плазмиду. В экспериментах с использованием баллистической трансформации в 80-е годы впервые была зафиксирована транзиентная активность введенных генов после обстрела тканей кукурузы [7], а также риса, пшеницы и сои [8].

Существенным фактором для успешного переноса генов при баллистической трансформации является необходимость проведения ряда предварительных обработок эксплантов. Это, в первую очередь, культивация эксплантов на среде, содержащей вещества, которые обладают осмотическим действием, такие как манит (0.2 М), сорбит (0.2 М), NaCl (1%) и др. Наибольшая эффективность трансформации была получена при выдерживании эксплантов на среде с осмолитиками не только до баллистической обработки, но и после обработки [9, 10]. Это позволяло ослабить негативные последствия повреждения клетки. Например, предварительная инкубация зародышей пшеницы в 0.4 М мальтозе в течение 4 ч и инкубация их в этом растворе в течение 45 ч после бомбардировки позволили получить растения со стабильной экспрессией вводимых генов. Количество частиц, используемых при бомбардировке, варьирует от 30 до 120 мг [11, 12]. Расстояние между ускорителем частиц и эксплантами также имеет существенное значение [13]. Важно, чтобы частицы c нанесенной ДНК проникали через клеточные стенки и при этом не вызывали гибели клетки.

Первое время для получения трансгенных растений в качестве мишени при баллистической

трансформации использовали эмбриогенную суспензионную культуру клеток [14-17]. Низкая степень агрегированности суспензии обеспечивала вероятность попадания микрочастиц с ДНК во все клетки мишени. Тем не менее, частота трансформации была очень низка. Например, при работе с суспензионной культурой клеток кукурузы вводимые гены обнаруживали только в одной из 5000 обработанных клеток [18]. Для получения одного трансгенного растения бомбардировали 7-10 чашек эмбриогенной суспензионной культуры кукурузы [19].

Позднее было показано, что баллистическим методом можно переносить гены не только в клетки суспензионных культур, но и в первичный [20, 21] и пассируемый эмбриогенный каллус [22], а также в различные ткани растений, такие, как примордии листьев [23] или незрелые зародыши [12, 22]. При использовании линий с низкими эм-бриогенными свойствами использовали меристе-матические ткани побегов, зиготические эмбрионы, незрелые зародыши [24-26]. Эффективность трансформации незрелых зародышей кукурузы в экспериментах Koziel с соавт. [27] составила 1%. После оптимизации метода баллистической трансформации частота появления трансгенных растений увеличилась до 3% [12].

Для упрощения процедуры трансформации вместо выделенной и очищенной ДНК использовали клетки Echerichia coli, обработанные 1%-ным фенолом и смешанные с микрочастицами вольфрама. При трансформации суспензионной культуры клеток кукурузы таким видом баллистического метода были получены тысячи клеток с транзиентной экспрессией и только шесть клеток со стабильной экспрессией введенных генов [28].

Постоянное усовершенствование установок для баллистической трансформации позволило сократить продолжительность и повысить точность микробомбардировки [29, 30]. В среднем, для разных объектов эффективность получения трансгенных растений баллистическим методом варьирует от 1 до 3%. В отдельных случаях, благодаря оптимизации метода, эффективность трансформации достигала 18.1% (из 127 каллусов было получено 23 трансформированных растения), но при этом не все растения экспрессирова-ли введенные гены [31].

Метод баллистической трансформации широко используют, и число сообщений об успешном получении трансгенных растений зерновых культур этим методом встречается наиболее часто. С применением этого метода получены трансгенные растения пшеницы (Triticum aestivum) [32-37], кукурузы (Zea mays) [38-41], трихордеума - гибрида ячменя и пшеницы (Hordeum X Triticum) [42], риса (Oryza sativa) [43, 44], ржи (Secale cereale) [45], ов-

са (Avena sativa) [46], ячменя (Hordeum vulgare) [47, 48] и других культур.

Среди недостатков этого метода следует отметить, прежде всего, невозможность контролировать число встроенных копий вводимого гена на одну клетку. При этом множественные копии генов вызывают "молчание" (silencing) генов. Многие из встроенных генов представлены в виде неполных последовательностей, что также приводит к нежелательным последствиям. Например, молекулярный анализ трансгенных растений кукурузы, полученных методом баллистической трансформации, показал, что число интегрированных фрагментов ДНК варьирует от 1 до 20 копий. Наиболее удачные растения были получены с 1-4 [19] и с 3-8 копиями [12].

Еще одним недостатком баллистического метода является ограничение размера вводимых генетических конструкций. Как правило, удается перенести фрагмент ДНК размером не более 10 т.п.н. Плазмиды большего размера плохо закрепляются на металлических частицах или разрушаются при "бомбардировке" [16, 31].

Несмотря на недостатки, метод балл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком