УДК 57.085.19
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ in vivo
Обзор
© 2012 г. А.А. Кучмий1*, Г.А. Ефимов1, С.А. Недоспасов12
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: +7(499)135-1405, электронная почта: isinfo@eimb.ru, kuchmiyanna@gmail.com, sergei.nedospasov@googlemail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс:+7(495)939-2776, электронная почта: info@mail.bio.msu.ru
Поступила в редакцию 16.04.12 После доработки 10.05.12
Визуализация отдельных молекул и клеточных популяций широко используется для изучения биологических процессов на молекулярном уровне и, в частности, при исследованиях иммунной системы. Благодаря появившимся новым методам, визуализация биологических объектов претерпела качественный переход от получения отдельных статических изображений к наблюдению за динамикой клеточных событий в организмах в реальном времени in vivo. Современные методы прижизненной визуализации позволяют локализовать клетки внутри органов и тканей, проанализировать процессы их дифференцировки, миграции, проследить события внутри одной клетки и межклеточные взаимодействия. Особую роль для изучения биологических процессов играют флуоресцентные методы прижизненной микроскопии. В настоящий момент постоянно совершенствуются свойства контрастных меток, стратегии их внедрения в организм и высокоточные биофизические методы их детекции. Новые подходы позволяют анализировать большее количество меток одновременно, при большем разрешении и на большей глубине. В обзоре описаны некоторые современные методы визуализации in vivo, с акцентом на флуоресцентные методы, и приведены примеры их использования в биологии и медицине.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: визуализация in vivo, флуоресценция, микроскопия, метка, «репортерные» мыши.
Современные достижения молекулярной биологии и развитие высокочувствительных методов визуализации дали начало новому направлению — визуализации индивидуальных молекул в экспериментальных животных in vivo. Важнейшее и уникальное свойство визуализации in vivo — это возможность неинвазивно (или микроинвазивно) в условиях, приближенных к физиологическим, получить изображение и наблюдать динамику молекулярных событий на уровне целого организма, на клеточном и субклеточном уровнях. Этот подход активно развивается и успешно применяется в фармакологических и медико-биологических исследованиях моделей человеческих заболеваний на экспериментальных животных.
Можно выделить ряд существенных преимуществ методов визуализации in vivo перед методами ex vivo: 1) для рутинной микроскопии необходимо выделение тканей из организма и их
* Адресат для корреспонденции.
химическая фиксация; таким образом, анализ производится в нефизиологических условиях; 2) такой анализ не отражает динамику клеточных процессов; 3) сложно осуществить количественную оценку после обработки ткани ex vivo; 4) реконструкция трехмерных объемных картин тканей при анализе серий гистологических срезов существенно затруднена.
Совокупность методов визуализации in vivo можно классифицировать по методу детекции (табл. 1). Выделяют большую группу методов, в которой детектируется ионизирующая радиация. Эти методы используют либо радиофармпрепараты, например, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), либо рентгеновское излучение, например, компьютерная томография (КТ). К методам, не использующим ионизирующее излучение, относят магнитную резонансную томографию (МРТ), ультразвуковые (УЗ) и оптические методы. Последние, в свою очередь, по принципу получения оптичес-
1603
Таблица 1. Методы визуализации ш vivo
С\ О
Экспериментальный подход
Принцип метода
Пространственное разрешение
Глубина
Чувствительность (М/л)
Количество пробы
Приложение
Преимущества
Недостатки
Ссылки
1
10
W Я О
X
я 2 я
ЬР
н о
и й я
к>
к> о
к>
ПЭМ
ОФЭКТ
КТ
БЛТ
реконструкция изображения, основанная на детекции у-лучей, полученных в результате реакции аннигиляции позитрона от Р-распада некоторых радионуклидов (150, 13]М", ПС 18Р, 1241)
визуализация, основанная на детекции у-фото-нов, образующихся в результате распада ядер изотопов с гамма-излуче-нием (99п1Тс, ш1, 1231, 1311, 1251)
реконструкция объемного изображения анатомических структур высокого разрешения, основанная на разном поглощении рентгеновских лучей структурами организма
детекция фотонов, полученных в результате биохимической реакции лю-
0,2—2 мм
без ограничений
10 11 10
0,1—2 мм
без ограничений
ю-10—ю-11
50-200 мкм
без ограничений
1—2 мм
1—2 см
~io-15-io-17
изучение метаболической функции (18Р—> —> глюкоза), экспрессии гена репортера (Б2]1/спиперон*), анализ взаимодействия рецептор—лиганд и ферментативных реакций
анализ экспрессии гена репортера (Н8У1-ТК/Р1А11**), анализ взаимодействия рецептор—лиганд
морфологические исследования — исследования костей, структур суставов, опухолевых метастазов в кости, определение размеров опухолей и их расположения, визуализация дыхательного древа, сосудов, сердца
экспрессия гена репортера, клеточные перемещения и прочее
высокая чувствительность, изотопы могут замещать атомы в составе молекулы интереса, количественное исследование
для получения изотопов не нужен циклотрон, можно анализировать несколько проб одновременно
визуализация анатомических структур, анатомическая привязка других методов визуализации
высокая чувствительность, быстрый, простой
необходим циклотрон для получения изотопов, короткое время полураспада изотопов, относительно низкое пространственное разрешение, нельзя анализировать несколько проб од-новременно, облучение
относительно низкое пространственное разрешение из-за использования коллиматора для детекции, облучение
ограниченное приложение для молекулярной визуализации, ограниченное разрешение мягких тканей, токсичность контрастирующих проб (препараты йода), облучение
низкое пространственное разрешение,
[1, 69, 70]
[1, 71, 72]
Я
Я »
£
[68, 73]
[3, 7]
tri
я о
X
я 2 я
ЬР
н о
и
и
to
to о
to
Окончание табл. 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
цифераза/люциферин в живых организмах способ хорошая проводимость для света только в по-верхностных слоях тканей
ФЛТ детекция фотонов видимого и инфракрасного света, полученных в результате возбуждения флуо-рофоров электромагнитной волной определенной длины 1—3 мм <1 см ~io-9-io-12 мкг-мг экспрессия гена репортера, клеточные перемещения и прочее высокая чувствительность, большое количество доступных меток низкое пространственное разрешение, хорошая проводимость для света только в по-верхностных слоях тканей [3,43]
МРТ измерение электромагнитного отклика ядер атомов водорода при возбуждении их радиоволнами в постоянном магнитном поле высокой напряженности 25-100 мкм без ограничений ю-3—ю-5 мкг-мг анатомическая визуализация, функциональное МРТ-наблю-дение перфузии органов, молекулярная МРТ — применение контрастной метки пр. гадолиний, Clio-Tat*** высокое пространственное разрешение, совмещает морфологическую и функциональную визуализацию длительное время сканирования, большой расход молекулярных проб, пробы в большом количестве могут быть токсичными [1, И 75]
УЗ реконструкция изображения мягких тканей, которая основана на разной проводимости этих тканей для ультразвука и различном отражении ультразвуковых волн (диапазон частот варьирует от 3—5 МГц до 30-50 МГц) 50-500 мкм мм, см мкг-мг морфологические исследования, гемоди-намическое исследование допплер-соно-графия, молекулярные пробы — антитела с липосомами анализ в реальном времени, низкая стоимость ограниченное пр остранствен-ное разрешение, в основном метод пригоден для морфологических исследований [1, 76, 77]
£
Со
К о о
tri
Со Я м
м
3
fa
0 to
to
Я
со
1
Я
I
Я
я
а"
о
* D2R — нефункциональный рецептор 2-го типа к допамину кодируется генетически, затем введение в организм специфического к D2R рецептору радиоак-тивномеченого лиганда 18F — спиперона, позволяет визуализировать распределение гена-репортера.
** HSV1-TK — тимидин-киназа 1 типа вируса герпеса кодируется генетически, затем распределение экспрессии гена-репортера определяется радиоактивно-ме-ченым субстратом FIAU.
*** CLIO-Tat частицы — содержат в своем составе монокристалл контрастного для МРТ суперпарамагнетика оксида железа CLIO и сигнал трансмембранного о\ транспорта Tat. Клетки, помеченные in vitro CLIO-Tat частицами, можно переносить в организм и визуализировать их распределение методом MPT. ^
ких фотонов подразделяются на биолюминесцентный и флуоресцентный (БЛТ — биолюминесцентная томография, ФЛТ — флуоресцентная томография). Методы флуоресцентной визуализации получили в молекулярной биологии наибольшее распространение в связи со своими оптимальными характеристиками. Области применения, преимущества и недостатки конкретных методов суммированы в табл. 1.
Визуализация in vivo (особенно с использованием оптических методов) получила важное приложение в исследованиях динамики иммунной системы и взаимодействия ее компонентов. В частности, был создан ряд «репортерных» линий животных — когда экспрессия определенной молекулы (транскрипционный фактор, белок адгезии, цитокин и пр.) сопровождается экспрессией флуоресцентного белка в живом организме. Таким образом, стало возможным проследить происхождение, дифференцировку, пролиферацию, выживание и миграцию клеток, экспрессирующих изучаемый белок.
Данный обзор рассматривает методологические подходы к прижизненной визуализации клеток, тканей и органов в организмах. Особое внимание уделено анализу флуоресцентных систем прижизненного исследования. Подробно описаны стратегии включения флуоресцентных сенсоров в клетки и разнообразие существующих флуорохромов. Наконец, приведены примеры конкретного приложения систем визуализации in vivo для изучения биологии цитоки-нов и динамики компонентов иммунной системы в норме и при патологиях.
ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ in vivo
Методы оптической визуализации позволяют наблюдать за распределением биомолекул и молекулярными со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.