ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 3, с. 229-232
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ =
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ОРГАНИЗУЮТ РИТМ СИНТЕЗА БЕЛКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННОГО СИНХРОНИЗИРУЮЩЕГО СИГНАЛА
© 2012 г. В. Я. Бродский, А. В. Васильев, В. В. Терских, Н. Д. Звездина, В. И. Фатеева, Л. А. Мальченко, Е. В. Киселева, Э. И. Буеверова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: brodsky.idb@bk.ru Поступила в редакцию 28.05.11 г. Окончательный вариант получен 29.11.11 г.
Изучали плотные 5-часовые культуры гепатоцитов крысы и такие же по плотности культуры мезен-химных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека или из костного мозга крысы. Клетки содержали в бессывороточной среде на стеклах, покрытых коллагеном. В отличие от гепатоцитов, в МСК не обнаружен ритм синтеза белка. После введения в среду с культурами МСК мелатонина (2 нМ, 5 мин) выявляется ритм. Опыты с хелатором цитоплазматического кальция ВАРТА-АМ и ингибитором протеинкиназ Н7 показали, что механизм организации ритма в МСК кальций-зависимый и определяется фосфорилированием белков.
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, гепатоциты, межклеточные взаимодействия, околочасовые ритмы, ритм синтеза белка.
В плотных культурах гепатоцитов и кератино-цитов обнаружен суммарный популяционный ритм синтеза белка (последние работы: Бродский и др., 2006, 2009, 2011). Ритм наблюдали вскоре после смены среды, что показывало самосинхронизацию колебаний интенсивности синтеза в результате прямых межклеточных взаимодействий. В не взаимодействующих клетках (например, в разреженных культурах) ритм не выявлялся. В опытах с агонистами и антагонистами внутриклеточных процессов была обоснована многоступенчатая последовательность взаимодействий между клетками, приводящих к ритму синтеза белка. Сигнал, действуя на специфические рецепторы клеточной мембраны, включал цепь процессов в цитоплазме, приводящих к синхронизации фаз индивидуальных колебаний. Задача новой работы — изучение кинетики синтеза белка в мезенхимных стромаль-ных клетках (МСК) при действии мелатонина. Как и в работах с эпителиальными клетками, ритм синтеза белка в МСК мог быть показателем прямых межклеточных взаимодействий. По некоторым данным (Вшк й а1., 2004; \aheri й а1., 2009), фибробласты, в отличие от эпителия, не контактируют друг с другом. Сохраняются ли в фибробла-стоподобных МСК прямые межклеточные взаимодействия? Способны ли МСК реагировать на внешний синхронизирующий сигнал?
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В основных опытах исследовали МСК, выделенные из биоптатов жировой ткани, полученных после абдоминальной пластики (Киселева и др., 2009). Клетки культивировали в среде ДМЕМ с 10% сыворотки, 5 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина и 10 нг/мл селенита натрия. Смену среды осуществляли каждые 3-е суток. По достижении монослоя клетки пассировали с использованием растворов 0.05% трипсина (Панэко) и Вер-сена (Панэко). На 3—4 пассаже клетки замораживали для долгосрочного хранения (при —196°С), в качестве криопротектора использовали 10% ДМСО. Для экспериментов нашей работы клетки размораживали и культивировали в течение 2— 3 недель. В работе использовали клетки 8—12 пассажей. Затем клетки снимали с пластика по стандартной методике с помощью растворов Версена и трипсина, клетки суспендировали, центрифугировали 10 мин при 200 g. Клеточный осадок ресус-пендировали в бессывороточной среде (среда 199 с добавлением 0.5 мкг/мл инсулина (Sigma) и 0.2 мг/мл альбумина для клеточных культур (Sigma) и далее содержали в этой среде. Суспензию, содержащую около 106 клеток в мл среды, вносили в чашку Петри с 30 мл среды над стеклами, покрытыми коллагеном. Через 3 часа культуры отмывали и переносили в свежую среду. Еще через 2 часа культуры вновь отмывали и через 15—60 мин ис-
!еогг
550
350
150 750
550
350
150
? 9
60
120
Время, мин
Кинетика синтеза белка в плотных культурах гепато-цитов крысы (вверху) и в таких же по плотности культурах мезенхимных стромальных клетках человека, выделенных из жировой ткани (внизу). Результаты двух опытов.
По оси абсцисс — время в мин. По оси ординат 1согг — включение 3Н-лейцина в белки с поправкой на пул свободного лейцина.
Каждые 10 мин в течение 2-х ч брали пробы по
3 культуры и в каждой культуре отдельно определяли 1согг (см. Методы).
Прямые линии — среднее 1согг для каждого опыта (36 культур).
следовали кинетику синтеза белка. В части опытов исследовали МСК из костного мозга крысы (Буе-верова и др., 2008).
Метод исследования кинетики синтеза белка детально изложен ранее (Вгоё8ку е! а1., 1992; Бродский и др., 2006). Пробы, по три культуры каждая, брали последовательно через 10 мин в течение 2 ч. Каждую культуру инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°С в среде с 3Н-лейцином (25— 30 мкО/мл, специфическая молярная активность 70—100 О/ммоль). Радиоактивность лейцина в белках и небелковой кислоторастворимой фракции, т.е. свободного лейцина в клетках измеряли в каждой культуре, используя сцинтилляционный счетчик LKB 1214 ЯаскЪе1а (Швеция). Рассчитывали относительное включение лейцина в белки с поправкой на пул свободного лейцина (формулу для расчетов см. в цитированных выше статьях). Каждый опыт ставили на культурах одной крысы.
Мелатонин в дозе 2 нМ вводили в среду с культурами на 5 мин, после чего культуры отмывали и переносили в свежую среду. Условия опытов с хе-латором кальция ВАРТА-АМ и ингибитором про-теинкиназ Н7 изложены в Результатах. Достоверность изменений интенсивности синтеза белка оценивали статистически.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении 1—3-суточных плотных культур гепатоцитов, через 10—15 мин после их отмывания и помещения в свежую бессывороточную среду выявляли околочасовой ритм синтеза белка (ссылки во Введении). Такой же ритм обнаружен и в 5-часовых культурах; различия между максимами и минимумами кривой высоко достоверны (например, рисунок). На этой кривой обнаружены два периода. В таких же по плотности культурах МСК ритм не выявляется: все точки апроксимиру-ются прямой. Но если в среду с такими культурами ввести на 5 мин 2 наноМ мелатонина, затем культуры отмыть и перенести в свежую среду без мела-тонина, ритм синтеза белка выявляется (таблица). Различия между максимумами и минимумами кинетической кривой не менее достоверны, чем для культур гепатоцитов. Принципиальные отличия между клетками в том, что гепатоциты самосинхронизируются без какого-либо экзогенного сигнала — аутокринно, а для синхронизации МСК требуется экзогенный сигнал, введенный в среду. Такие же результаты получены нами при изучении МСК, выделенных из костного мозга крысы.
Ранее был изучен внутриклеточный механизм синхронизации гепатоцитов и кератиноцитов (ссылки во Введении). В опытах с хелатором цито-плазматического кальция ВАРТА-АМ было показано, что блокирование выброса ионов кальция из внутренних депо ликвидирует ритм в плотных
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ОРГАНИЗУЮТ РИТМ
231
Примеры кинетики 1согг — включения 3Н-лейцина в белки поправкой на пул свободного лейцина (срт) в плотные культуры с 10-мин интервалами в течение 2-х часов. В таблице приведены максимумы (макс) и минимумы (мин) кривой1
Объект Контроль Мелатонин ВАРТА-АМ или Н7 предобработка до мелатонина
макс мин макс мин макс мин
Гепатоциты 498 ± 66 250 ± 44 561 ± 46 382 ± 06
416 ± 15 239 ± 14 674 ± 76 400 ± 32
520 ± 68 566 ± 65
Мезенхимные стромальные клетки Все точки кривой достоверно не отличаются друг от друга и от средней для всего опыта 204 ± 24
437 ± 52 254 ± 07
458 ± 14 322 ± 30
624 ± 54 214 ± 16
2285 ± 106 854 ± 91 Все точки кривой достоверно не отличаются друг от друга и от средней для всего опыта
1984± 43 1233 ± 112
1 На каждой строке слева — 1согг ± ошибка на первом максимуме кинетической кривой, правее — соответствующий минимум, строкой ниже — следующий максимум и минимум, строкой ниже — следующие значения той же кривой. Кривая может начинаться с минимума.
культурах и снимает синхронизирующий эффект внешних сигналов — ганглиозидов или моноаминов. Инактивация протеинкиназ ингибитором Н7 также ликвидировала ритм синтеза белка в гепато-цитах и кератиноцитах. Также и в исследовании МСК блокирование изменений кальция ВАРТА-АМ (20 мкМ, 1 час) с последующим введением в среду 2 нМ мелатонина полностью снимало синхронизирующий эффект мелатонина. Таким же был результат предобработки культур МСК ингибитором протеинкиназ (в основном, протеинки-назы С) с помощью Н7 (40 мкМ, 1 час).
Какова возможная причина различий организации кинетики синтеза белка в гепатоцитах и МСК? В эпителии нарушение межклеточных связей включает апоптоз (Harper et al., 2003). Напротив, экспериментальная инициация контактов между фибробластами приводит к их гибели (Bizik et al., 2004). Влияние связей между фибробласто-подобными МСК на их жизнеспособность не ясна. По нашему критерию прямых межклеточных взаимодействий — ритму синтеза белка — такие связи в МСК, во всяком случае, ослаблены сравнительно с эпителием. Но на внешний синхронизирующий сигнал MCK реагируют, причем механизм их синхронизации такой же, как в эпителии: сигнал на мембране —»- изменения ионов кальция —»-—стимуляция протеинкиназ —»- фосфорилиро-вание белков.
Благодарим В.С. Михайлова, В.Н. Симирского
и В.И. Старостина и О.В. Паюшину за замечания.
Авторы благодарят РФФИ за поддержку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бродский В.Я., Звездина Н.Д., Фатеева В.И., Маль-ченко Л.А. Механизм прямых межклеточных взаимодействий. Самоорганизация ритма синтеза белка // Онтогенез. 2006. Т. 37. № 4. С. 384-393.
Бродский В.Я., Голиченков В.А., Звездина Н.Д., Фатеева В.И., Мальченко Л.А. Мелатонин синхронизирует ритм синтеза белка в культурах гепатоцитов как агонист внутриклеточного кальция и протеин-киназ // Онтогенез. 2009. Т. 40. № 3. 231-236.
Бродский В.Я., Терских В.В., Васильев А.В., Звездина Н.Д., Воротеляк Е.А., Фатеева В.И., Мальчен-ко Л.А. Самоорганизация ритма синтеза белка в культурах HaCaT кератиноцитов человека // Онтогенез. 2011. Т. 42. № 4.
Буевер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.