научная статья по теме МЕЖВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗНОГО ДОМЕНА ГЕНОВ САХАРОЗОСИНТАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА MALUS И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ROSACEAE Биология

Текст научной статьи на тему «МЕЖВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗНОГО ДОМЕНА ГЕНОВ САХАРОЗОСИНТАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА MALUS И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ROSACEAE»

ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 12, с. 1472-1475

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 575.174.015.3:582.734.3

МЕЖВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗНОГО ДОМЕНА ГЕНОВ САХАРОЗОСИНТАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА Malus И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ Rosaceae

© 2014 г. К. В. Борис1, 2, Е. З. Кочиева2, 3, А. М. Кудрявцев1

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991

e-mail: docboris@mail.ru 2Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра биотехнологии, Москва 119234 Поступила в редакцию 31.07.2014 г.

Впервые идентифицированы последовательности, кодирующие основной функциональный глю-козилтрансферазный домен генов сахарозосинтазы у 14 представителей рода Malus и родственных видов семейства Rosaceae и изучен их полиморфизм. В изученных последовательностях были обнаружены единичные нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в последовательности белка, и в том числе в последовательности консервативного трансмембранного мотива, характерного для всех генов сахарозосинтазы высших растений.

DOI: 10.7868/S0016675814120029

В настоящее время большое внимание уделяется изучению факторов, влияющих на формирование и качество урожая плодовых культур семейства Rosaceae, имеющих огромное хозяйственно-экономическое значение.

Известно, что рост, созревание и качество плодов у растений во многом зависят от транспорта и метаболизма углеводов. В отличие от других растений плодовые деревья семейства Rosaceae используют в качестве основных транзитных углеводов сахарозу и сорбитол. Показано, что именно соотношение сахароза/сорбитол во многом определяет качество плодов, их сахарокислотный баланс [1]. Поэтому отдельный интерес представляет изучение ферментов метаболизма данных углеводов и кодирующих их генов у представителей Rosaceae.

Одним из ключевых ферментов углеводного метаболизма плодов яблони является сахарозо-синтаза (SS/Sus), обеспечивающая обратимое расщепление сахарозы в присутствии УДФ на УДФ-глюкозу и фруктозу. Именно сахарозосин-таза отвечает за расщепление поступающей в плоды сахарозы.

У яблони (Malus domestica) было выявлено пять изоформ сахарозосинтазы, локализованных в ци-тозоле, митохондриях или пластидах, однако нет окончательных данных о количестве кодирующих их генов и локализации их в геноме [2]. У груши (Pyrus serótina) было выявлено наличие двух изоформ сахарозосинтазы. Изоформа SSI участвует в деградации и транслокации сахарозы в мо-

лодых плодах, в то время как SSII принимает участие в ресинтезе сахарозы в зрелых плодах [3].

Однако, несмотря на важность данного фермента, у большинства плодовых культур семейства Rosaceae полные последовательности и число копий гена сахарозосинтазы до сих пор не определены. Известны кодирующие последовательности генов сахарозосинтазы только персика (Prunus pérsica) и яблони (Malus domestica), геном которых секвенирован. Отсутствуют также данные о полиморфизме последовательностей генов сахарозосинтазы и возможном влиянии мутаций на активность соответствующего фермента у плодовых культур семейства Rosaceae.

Известно, что гены сахарозосинтазы высших растений имеют два основных функциональных домена — сахарозосинтазный и глюкозилтранс-феразный [4]. В данной работе были впервые се-квенированы последовательности, кодирующие глюкозилтрансферазный домен, у 14 различных представителей Rosaceae и описан их нуклеотид-ный и аминокислотный полиморфизм.

Для работы были отобраны 14 образцов, включающих различных представителей рода Malus, а также родственные виды, предоставленные Всероссийским научно-исследовательским институтом генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина и Майкопской опытной станцией ВИР им. Н.И. Вавилова (табл. 1). Тотальную ДНК для всех отобранных образцов выделяли с использованием стандартной методики [5].

Таблица 1. Виды Ко8аееае, выбранные для анализа

Вид Каталожный номер Вид Каталожный номер

Malus domestica сорт Успенское - Malus asiatica 2343

Malus sargentii 2428 Malus sylvestris 3122

Malus cerasifera 29494 Malus pumila 2383

Malus sieboldii 2322 Sorbus aucuparia -

Malus arnoldiana 2312 Pyrus elata -

Malus floribunda 2346 Cotoneaster lucidus -

Malus caspiriensis 14942 Crataegus nigra -

Примечание. Образцы, имеющие номер, предоставлены Майкопской опытной станцией ВИР им. Н.И. Вавилова, без номеров получены из ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина.

На основе данных об известных кодирующих последовательностях генов сахарозосинтазы таких плодовых культур семейства Rosaceae, как персик (P. pérsica) и яблоня (M. domestica), была разработана комбинация праймеров (F 5'GTCT-TCGATCCCAAGTTCAAC3' и R 5'GTAAACAAC-CAATGCTTCCGC3'), которые позволяют ампли-фицировать участки генов сахарозосинтазы, включающие последовательности, кодирующие глюкозилтрансферазный домен у всех выбранных для анализа образцов.

Амплификацию проводили по стандартной методике с использованием набора реактивов производства "Диалат ЛТД" (Россия) в режиме: денатурация — 30 с при 94°С; отжиг праймера — 35 с при 59°С; синтез ДНК — 1 мин при 72°С с числом циклов — 35 и предварительной денатурацией — 5 мин (94°С). Заключительную элонгацию ПЦР фрагментов проводили 10 мин при 72°С [6].

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов сахарозосинтазы проводили при помощи системы BigDye (Applied Biosystems) стандартным методом на ABI 310 capillary DNA Analyzer с использованием соответствующих праймеров. Выравнивание и анализ последовательностей проводили с помощью программы MEGA 5.1 [7].

В анализ было отобрано девять представителей рода Malus и пять родственных представителей подсемейства Spiraeoideae (сем. Rosaceae) (табл. 1). Последовательности глюкозилтрансферазного домена всех отобранных образцов были амплифици-рованы, секвенированы и проанализированы.

Протяженность последовательностей, кодирующих глюкозилтрансферазный домен генов саха-розосинтазы, у всех изученных в данной работе представителей семейства Rosaceae составила 564 пн. На сегодняшний день выделяют четыре типа генов сахарозосинтазы растений, в том числе по экзон-интронной структуре [8, 9]. Так, например, у известных ¿Us-генов арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) протяженность последовательностей,

кодирующих глюкозилтрансферазный домен, варьирует от 564 до 567 пн, а в случае с генами типа SUSA (AtSUS2 и AtSUS3) последовательность, кодирующая глюкозилтрансферазный домен, состоит из двух экзонов протяженностью 322 и 242 пн соответственно [4]. Все проанализированные последовательности представителей Rosaceae были непрерывны и кодируются одним экзоном. Подобное строение последовательностей, кодирующих глюкозилтрансферазный домен, также характерно, например, для двух известных генов сахарозо-синтазы картофеля (Solanum tuberosum) [10, 11]. BLAST-анализ полученных последовательностей выявил гомологию с экзоном XI гена сахарозосинтазы яблони M. domestica сорта Golden Delicious [12].

В изученных последовательностях мы не выявили инсерций и делеций, однако был обнаружен ряд единичных нуклеотидных замен. Общий уровень межвидового полиморфизма составил 7.6%. Всего было выявлено 43 вариабельных сайта, при этом только 16 из них у видов рода Malus.

Общий уровень полиморфизма изученного фрагмента для видов Malus составил 2.8%. Для сравнения скажем, что анализ последовательностей глюкозилтрансферазного домена у сортов картофеля (S. tuberosum) показал наличие 13 вариабельных сайтов, а общий уровень полиморфизма составил 2.4% [11]. Межвидовой полиморфизм генов сахарозосинтазы трех видов сахарного тростника (Saccharum), например, не превышает 1.9% [13]. В то время как анализ фрагмента гена сахарозо-синтазы у гексаплоидной мягкой пшеницы (T. aestivum) показал инвариантность последовательностей этого гена на хромосомах 2A и 2D, а его гомолог на хромосоме 2В был полиморфен [14].

Кроме того, в изученных последовательностях были выявлены нуклеотидные замены, характерные для групп видов. Так, все изученные образцы рода Malus имели замену T/A в положении 431, не характерную для остальных проанализированных видов Rosaceae.

1474

БОPИС и др.

Таблица 2. Аминокислотные замены, выявленные в результате анализа последовательностей, кодирующих глю-козилтрансферазный домен видов Ко8асеае

№ Аминокислотная замена (положение) Кодон Образец Тип замен*

1 M/L (3) ATG/TTG Crataegus nigra К

2 I/F (11) TTC/ATC Malus asiatica P

3 P/T (24) CCT/ACT Malus sieboldii К

4 S/A (34) TCC/GCC Cotoneaster lucidus К

5 K/R (37) AAA/AGA Malus caspiriensis К

6 L/V (43) GTT/CTT Malus domestica, Malus asiatica, Malus caspiriensis, Malus sargentii, Malus sylvestris, Pyrus elata, Crataegus nigra К

7 I/N (56) ATT/AAT Crataegus nigra, Sorbus aucuparia, Pyrus elata P

8 Q/K (73) CAG/AAG Cotoneaster lucidus P

9 M/I** (118) ATG/ATT Sorbus aucuparia К

10 S/C(123) TCT/TGT Cotoneaster lucidus P

11 M/K (132) ATG/AAG Pyrus elata P

12 S/G (133) AGT/GGT Malus pumila К

13 I/K (143) ATA/AAA Crataegus nigra, Sorbus aucuparia, Pyrus elata, Coto-neaster lucidus P

14 L/F (164) TTG/TTT Pyrus elata P

15 S/Y (186) TCC/TAC Malus sargentii P

* К — консервативная аминокислотная замена, Р — радикальная аминокислотная замена. ** Жирным шрифтом выделены замены в пределах трансмембранного мотива.

В связи с тем, что аминокислотная последовательность белка определяет его основные функции, именно она представляет наибольший интерес. Полученные последовательности были транслированы и их протяженность составила 187 а.о. Из 43 единичных нуклеотидных замен, выявленных в последовательности изученного фрагмента, 15 приводили к заменам аминокислот. Среди них восемь замен радикальные и семь — консервативные (табл. 2). Большее количество аминокислотных замен наблюдали в последовательностях образцов, не относящихся к роду Malus. Так, для образцов Crataegus, Pyrus и Sorbus характерна общая радикальная замена изолей-цин/аспарагин. А для образцов Crataegus, Sorbus, Pyrus и Cotoneaster — замена изолейцин/лизин (табл. 2).

Известно, что в последовательностях генов са-харозо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком