ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 639-644
УДК 631.46
Mierobaeterium oxydans - СИМБИОНТ ХОМЯЧКА КЭМПБЕЛЛА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ
© 2004 г. Н. А. Ушакова*, Н. Ю. Феоктистова*, Т. В. Колганова**, Т. П. Турова***
*Институт проблем экологии и эволюции им.А.Н.Северцова РАН, Москва, 119071;
e-mail Ushakova@sevin.ru **Институт микробиологии РАН, Москва, 117312 ***Центр "Биоинженерия" РАН, Москва, 117312 Поступила в редакцию 16.10.2003 г.
Из секрета специфических железистых комплексов в устье рта хомячка Кэмпбелла (Phodopus camp-belli) выделен резидентный микроорганизм (штамм Хо-17), который по культурально-морфологи-ческим и физиологическим свойствам, а также данным филогенетического анализа на основании секвенирования последовательностей гена 16S рРНК и анализа состава клеточной стенки отнесен к виду Microbacterium oxidans. Выделенная бактерия проявляла пробиотические свойства при введении суспензии живых клеток сирийскому хомяку (Mesocricetus auratus), per os в течение 20 сут выразившиеся в увеличении массы тела и ряда внутренних органов, стимуляции клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
Одним из направлений фундаментальных исследований современной биологии, медицины и ветеринарии является разработка теоретических подходов к созданию препаратов пробиотическо-го действия - препаратов нового поколения, которые применяются для нормализации обменных процессов организма и функций желудочно-кишечного тракта. Пробиотические препараты стимулируют усвоение и перевариваемость кормов, обеспечивают интенсивный рост и развитие животных [1, 2]. Дикие животные представляют собой обширный и мало изученный источник микроорганизмов, обитающих на их наружных покровах, слизистых и в желудочно-кишечном тракте, которые могут быть использованы для биотехнологических целей при поиске новых пробиотиков.
В углах рта у устья защечных мешков хомячка Кэмпбелла (РЪойорт сашрЪвШ) имеются специфические железистые комплексы. Они представляют собой кожные мешкообразные образования, заполненные секретом со специфическим запахом, количество которого у одного взрослого животного может достигать 20-30 мг. Секрет обладает амилолитической и протеолитической активностями, сопоставимыми с таковыми в желудке [3], и имеет большое значение для нормального существования как взрослых особей [4], так и для роста и развития детенышей хомячка Кэмпбелла, особенно в период перехода их на самостоятельное питание [5]. Секрет нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта, стимулирует обменные процессы, иммунитет. Ранее было показано, что секрет является местом обитания симбионтных бактерий, передающихся де-
тенышам от родителей [6]. Состав микробного ценоза секрета у детенышей меняется в онтогенезе и окончательно сформировывается к началу самостоятельного питания. В случае удаления у родителей мешочков с секретом, у детенышей, не получавших секрета, развивалась дистрофия и тяжелые функциональные нарушения. При этом в секрете специфических железистых комплексов детенышей наблюдался дефицит одной из доминирующих форм бактерий нормально сформированного микробного сообщества, что указывало на важное функциональное значение данного симби-онтного микроорганизма. В результате проведенной работы штамм (Хо-17) был выделен из секрета взрослых особей.
Цель работы - идентификация штамма Хо-17 и изучение его пробиотических свойств на детенышах сирийского хомяка (Mesocricetus auratus).
МЕТОДИКА
Для выделения чистой культуры из свежевы-деленного секрета дополнительных мешочков в устье рта взрослых клинически здоровых хомячков Кэмпбелла образцы проб секрета высевали в МПБ и кукурузно-глюкозную среду с кобальтом [7] и культивировали в микроаэрофильных условиях при 30°С. Морфометрию осуществляли с использованием микроскопа Axioskop и компьютерной системы анализа изображений KS300 ("Karl Zeiss", Германия). Физиолого-биохимические свойства изучали методами общей микробиологии [8].
Витамин В12 определяли микробиологическим методом с помощью тест-культуры E. coli 113-3.
Препарат нативной клеточной стенки получали из 5 г сырой биомассы Хо-17, выращенной на МПБ. Клетки, суспендированные в 30 мл Na-фос-фатного буфера, рН 7.0, разрушали на шаровой мельнице (10000 об/мин, 4°С, 20 мин). Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием (30 мин, 1500 g), клеточные стенки из супернатан-та осаждали (15 мин, 60000 g). Для анализа аминокислот пептидогликана препарат клеточной стенки обрабатывали раствором трипсина в фосфатном буфере (37°С, 6 ч) и ДДС-Na (кипячение 5 мин) и гидролизовали (6 н. HCl, 105°С, 18 ч). Аминокислотный состав определяли на анализаторе фирмы "Hitachi" (Япония). Тип пептидогликана определяли по молярному соотношению аминокислот пептидной части пептидогликана [9].
Содержание экспериментальных животных. Хомяков Mesocricetus auratus и хомячков Кэмп-белла Phodopus campbelli содержали в виварии ИПЭЭ РАН на стандартной диете, температурном и световом режиме.
Изучение состояния иммунитета золотистых хомяков Mesocricetus auratus оценивали по содержанию основных классов сывороточных иммуноглобулинов А, М, G методом радиальной имму-нодиффузии по Манчини, а также по Лоури после хроматографического разделения на колонке с ДЭ-52 целлюлозой. Пролиферативную активность лимфоидных клеток оценивали в реакции бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ) по включению в ДНК клеток 3Н-тимидина. Для получения культур лимфоцитов у мышей в стерильных условиях извлекали селезенку. Взвесь спленоцитов получали путем выдавливания в гомогенизаторе. Для получения одной клеточной взвеси использовали 4 синглетные особи. Спленоциты от интакт-ных и вакцинированных хомяков культивировали микрометодом в 0.2 мл среды роста в 96-луноч-ных планшетах ("Cоstar") при 37°С в атмосфере 5% С02 в течение 96-120 ч. Предварительно проверяли жизнеспособность выделенных клеток путем добавления 0.1%-ного раствора трипанового синего по отсутствию окраски у 96% клеток. При высеве клеток в среду для роста добавляли (или нет) антигены: специфический антиген Б в разведении 1 : 10 - 100 (АГ) и неспецифический - кон-канавалин А (КонА) (5-10 мкг/мл) или фитоге-магглютинин (ФГА) (0.5 мкл/мл). Митогены применяли в ранее установленных оптимальных концентрациях. На каждый вариант опыта использовали не менее 5-6 лунок. В качестве контроля для специфического антигена использовали коммерческую инактивированную герпетическую поливакцину. Планшеты со специфическим антигеном культивировали 120 ч, с неспецифическим антигеном - 72 ч. За 16 ч до окончания инкубации в лунки вносили 1.0 мкКю 3Н-тимидина, после чего пробы помещали на лед, а затем собирали на фильтры. Степень включения метки определя-
ли в сцинтилляционном счетчике "Packard" (США). Пролиферативную активность клонов лимфоцитов оценивали в импульсах в 1 мин или с помощью индекса стимуляции, который вычисляли как отношение радиоактивности в культурах лимфоцитов с антигеном/митогеном, к соответствующим величинам радиоактивности в контрольных культурах (со средой).
В эксперименте использовали детенышей обоего пола. Суспензию 2-суточных клеток бактерий в физиологическом растворе ежедневно капали в рот новорожденным экспериментальным животным по 0.2 мл в течение 20 сут. Наблюдали за состоянием волосяного покрова, поведением, экскрементами. По окончании эксперимента у животных брали кровь на анализ состояния иммунитета, а также определяли абсолютную и относительную массу тела и внутренних органов путем взвешивания. Результаты обрабатывали статистически.
Выделение ДНК из бактерий проводили согласно методу [10]. Концентрация полученных препаратов ДНК при использовании этого метода составляла 30-50 мкг/мл. РНК в полученных препаратах присутствовала в следовых количествах (менее 1% согласно данным электрофоретическо-го анализа). Всего было получено 2 независимых препарата ДНК для исследованного материала.
ПЦР гена 16S рРНК и секвенирование полученных продуктов. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и дальнейшего секвенирования ПЦр-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система [11].
Состав реакционной смеси для ПЦР: прайме-ры - по 25 пмоль каждого; 10Х буфер - 2.5 мкл; 2 мМ ДНТФ - 2.5 мкл; BioTaq полимераза ("Диа-лат", Россия, 5.0 Е/мкл) - 0.2 мкл; ДНК-матрица -50 нг; H2O - до 25 мкл.
Реакцию проводили по следующей схеме: 30 циклов: 94°С - 0.5 мин; 45°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; окончательная полимеризация - 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2%-ном геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII ("Biometra", Германия).
Выделение и очистку продуктов ПЦР, соответствующих различным областям гена, проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps фирмы "Promega" (США) согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование продуктов ПЦР проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing, "Promega" согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. При этом для секвенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры и чтение проводили в двух направлениях.
Анализ последовательностей 168 рРНК. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью сервера В^а. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы [12]. Построение
бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий осуществляли с помощью методов, реализованных в пакете программ Тгеееои [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Филогенетическая характеристика штамма
Хо-17. У исследуемого штамма Xo-17 была определена почти полная последовательность нуклео-тидов гена 16S рРНК (1438 нуклеотидов), что соответствует позициям с 32 по 1506 по номенклатуре E. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к филогенетическому подразделению грам-положительных бактерий с высоким содержанием ГЦ-пар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.