МиНробиота детей
Александр Николаевич Суворов, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург). Занимается исследованием молекулярных механизмов патогенности бактерий (в частности стрептококков) и изучением свойств пробиотиков. Лауреат премии РАМН за цикл работ по генетике стрептококков (в соавторстве с А.В.Дмитриевым, 1998).
А.Н.Суворов
Видовая организация микро-биоты детей (в первую очередь, новорожденных) до сих пор изучена плохо. Даже в медицинской профессиональной среде бытует множество недоказанных концепций, а порой и легенд. Считается, что здоровье и состояние иммунитета младенца зависят от наличия в его организме лакто- и бифи-добактерий. Если ребенок не получит их в должном количестве, то микробиота не сформируется в том виде, как ей положено, возникнет дисбиоз и не разовьется иммунитет. Однако при всей привлекательности и простоте устоявшихся представлений прямых доказательств их справедливости немного, а пока нет доказательств, научные построения остаются лишь гипотезами или даже научными мифами. Оставив в покое мифы, попытаемся разобраться, насколько современная наука продвинулась в понимании процесса формирования детской микробиоты и ее изменений с возрастом. Но для начала уточним, что считается нормальной микрофлорой человека, какие существуют подходы к оценке ее состава и функционального состояния.
Состав микробиоты и дисбиоз
Организм среднего взрослого человека — естественный резервуар и источник пропитания для 3 кг бактерий. Их число,
© Суворов А.Н., 2011
по современным представлениям, в сотни раз превосходит число наших собственных клеток, при этом знаем мы о микроорганизмах и их роли в физиологии человека постыдно мало. До самого последнего времени в сообществе врачей была распространена следующая информация: в кишечнике присутствует индигенная (резидентная) и транзиторная (случайная) микрофлора. Индигенных микроорганизмов разделяют на облигатных (главных) и факультативных, которых меньшинство. К облигатным относят бифи-добактерий, бактероидов, пеп-тострептококков, а к факультативным — лактобацилл, кишечных палочек и энтерококков. «Случайными» считаются клеб-сиеллы, клостридии, протеи, стафилококки, грибы рода Candida, многие из которых попадают в разряд так называемых условно патогенных микроорганизмов. У здорового человека их должно быть не более 1% от
общего количества бактерий кишечника.
На этих представлениях основаны руководства и стандарты для практикующих врачей. В частности, в ОСТ 91500.11.00042003 определены границы нормальных концентраций бактерий в образцах кала взрослых и детей (табл.1). Нетрудно заметить, что в стандарте предлагается оценивать количества наиболее жизнеспособных и легко культивируемых видов микроорганизмов. Объясняется это просто: только этих микроорганизмов позволяет выявлять бактериологический метод анализа, до сих пор используемый в нашей стране. Его результаты драматически расходятся с данными, получаемыми с помощью современных методов. Уже не секрет, что подавляющее большинство бактерий кишечника относятся к строгим анаэробам (они живут при полном отсутствии кислорода), поэтому образец, содержащий бактериальную
биомассу, должен моментально попадать в особые, анаэробные, условия культивирования, которые непросто создать в лаборатории. Таким образом, обычно определяют лишь те виды бактерий, которые удалось вырастить, сознательно или бессознательно отметая остальные, трудно культивируемые.
Совсем непонятный критерий диагностики, указанный в стандарте, — «лактобактерии». Если предположить, что этот термин равноценен английскому «lactic acids bacteria» — широкой группе молочнокислых бактерий, куда, по международной номенклатуре, входит 11 родов, в том числе стафилококки и энтерококки, тогда неясно, почему они отмечены отдельно в других графах. Если же к лакто-бактериям относить только лак-тобацилл, то почему бы не использовать это общепринятое родовое название? Правда, в таком случае из категории лакто-бактерий выпадут термофильные стрептококки или лакто-кокки, столь часто используемые при изготовлении молочных продуктов.
При всех несуразностях и несоответствиях современным данным бактериологический анализ — по-прежнему основной инструмент российских клиницистов, который они ис-
Таблица 1
Стандарт, определяющий количественные показатели микроорганизмов в кале
Группы микроорганизмов Возраст, годы
<1 1-60 >60
Бифидобактерии 1010-10п 109-1010 108-109
Лактобактерии 106—107 107-108 106-107
Бактероиды 107-108 109-1010 1010-1011
Энтерококки 105-107 105-108 106-107
Фузобактерии <106 108-109 108-109
Эубактерии 106-107 109-1010 109-1010
Пептострептококки <105 109-1010 1010
Клостридии < 103 < 105 < 106
E.coli типичные 107-108 107-108 107-108
E.coli лактозонегативные <105 <105 <105
E.coli гемолитические 0 0 0
Другие условно патогенные энтеробактерии <104 <104 <104
Стафилококк золотистый 0 0 0
Стафилококки (сапрофитный, эпидермальный) < 104 < 104 < 104
Дрожжеподобные грибы рода Candida < 103 < 104 < 104
Неферментирующие бактерии < 103 < 104 < 104
пользуют для оценки состояния микробиоты и выявления патологий — дисбактериоза, или дисбиоза, кишечника. Это состояние характеризуется нарушением количественных и качественных показателей микробиоценоза, приводящее к негативным последствиям для здоровья. Диагностику дисбиоза в настоящее время проводят в соответствии с методическими рекомендациями Министерства здравоо-
хранения СССР, разработанными еще в 1986 г. (табл.2). Неудивительно, что критерии определения дисбиоза вызывают много критики и в научной печати, и в Интернете: стандарты, на которые опираются врачи при постановке диагноза, устарели и не отражают в полной мере реального состояния микрофлоры кишечника и ее биоразнообразия. Связано это с ограниченными методическими возмож-
Таблица2
Критерии бактериологической диагностики дисбактериоза согласно методическим рекомендациям Министерства здравоохранения СССР от 14.04.86. 10-11/31
Дисбактериоз Характеристика
I степень (латентная, компенсированная форма) Незначительные изменения в аэробной части микробиоценоза (увеличение или уменьшение количества кишечной палочки), бифидо- и лактофлора не изменены. Кишечные дисфункции, как правило, не регистрируются
II степень Незначительное снижение количественного содержания бифидобактерий, количественные
(субкомпенсированная форма) и качественные изменения кишечной палочки или других условно патогенных
микроорганизмов
III степень Значительное снижение уровня бифидофлоры (105—107 КОЕ/г) в сочетании со снижением
лактофлоры и резким изменением уровня кишечных палочек. Вслед за снижением бифидофлоры нарушаются соотношения в составе кишечной микрофлоры, создаются условия для проявления патогенных свойств условно патогенных микроорганизмов. Как правило, возникают кишечные дисфункции
IV степень Отсутствие бифидофлоры, значительное уменьшение лактофлоры и изменение количества
кишечной палочки (снижение или увеличение), возрастание как облигатных, так и факультативных и нехарактерных для здорового человека видов условно патогенных микроорганизмов в ассоциациях
ностями бактериологической лаборатории в России.
Мировая наука в настоящее время переживает необычайный всплеск интереса к нормальной микрофлоре человека. Для ее изучения созданы новые технологии, главное преимущество которых в том, что теперь нет необходимости культивировать анализируемые микроорганизмы. В отличие от бактериологического анализа методы молекулярной генетики не зависят ни от среды, ни от условий культивирования, ни от степени жизнеспособности микрофлоры. Идентифицировать вид бактерии теперь можно по специфичным нуклеотидным последовательностям. Более того, появилась возможность определять не только качественный состав и количественное соотношение микробных сообществ, но и функциональные особенности каждого вида. В будущем с диагностическим потенциалом молекулярной генетики, пожалуй, сможет поспорить лишь масс-спектромет-рия, однако весьма перспективный и активно развивающийся метод «MALDI-TOF» (Matrixassisted laser desorption ioniza-tion-time of flight) только в начале пути и все возможности этого метода до конца не исследованы [1].
При всем разнообразии мо-лекулярно-генетических методов для дифференцировки штаммов особую ценность представляют два подхода. Первый — анализ уникальной последовательности рибосомной РНК: обычно расшифровывают (секвениру-ют) ДНК-фрагмент между генами 16S и 23S РНК или просто область, кодирующую 16S, которую затем сопоставляют с последовательностями ДНК, представленными в базе данных «GenBank» на сервере Национального центра биотехнологической информации США. При втором подходе проводится анализ полного генома, основанный либо на микрочиповой гибридизации, либо на субтрактивной гибридиза-
ции, либо на реакции ПЦР в реальном времени, либо на полногеномном секвенировании [2]. Очевидно, что вторая группа исследований дает более детальную и более полную картину — она характеризует микроорганизмы, входящие в состав мик-робиоты, как качественно, так и количественно, однако и анализа области 16Б РНК обычно достаточно для точной видовой идентификации.
К настоящему времени достоверно установлено, что истинный состав микрофлоры кишечника существенно отличается от указанного в стандартах. Больше всего в кишечнике здорового человека микроорганизмов, относящихся к двум крупным сообществам — бактероидов (Bacteroidetes) и фирмику-тов (Firmicutes), каждое из которых состоит из множества родов. Бактероиды — группа анаэробных грамотрицательных бактерий трех классов (Ва^-roidetes, Flavobacteria и БрЫ^о-Ьа^па), объединяющих множество родов и видов. Фирмику-ты — преимущественно грам-положительные бактерии двух основных классов (бацилл и клебсиелл). К ним относятся и хорошо знакомые бактериологам стрептококки, стафилококки, лактобациллы, энтерококки, и менее известные, но более многочисленные вейлонеллы, руминококки, эубактерии, пеп-тострептококки (табл.3). Самые же распространенные фирмику-ты — клост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.