научная статья по теме МИКРОБИЦИДЫ С АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ АДДУКТОВ УГЛЕРОДНЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ Биология

Текст научной статьи на тему «МИКРОБИЦИДЫ С АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ АДДУКТОВ УГЛЕРОДНЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 1, с. 21-25

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

МИКРОБИЦИДЫ С АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ АДДУКТОВ УГЛЕРОДНЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ

© 2011 г. А.В. Гилязова*'**, Г.В. Корнилаева**, А.Н. Пономарев***, В.А. Черешнев****, Э.В. Карамов***

*ФГБУ «ГНЦИнститут иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия;

**ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ, Москва, Россия;

***НТЦ «Прикладныхнанотехнологий», Санкт-Петербург, Россия;

****Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия

Поступила: 07.06.2010. Принята: 25.08.2010

Принимая во внимание увеличение количества новых случаев ВИЧ-инфекции среди женщин, особенно в развивающихся странах, создание топических микробицидов становится важной частью комплексных мер по профилактике ВИЧ/СПИД. В рамках данной работы мы провели исследование водорастворимых аддуктов нанокластеров углерода (АНКУ), активных в отношении штаммов ВИЧ-1, для разработки анти-ВИЧ микробицидов. Все исследованные водорастворимые аддукты углеродных нанокластеров, различающиеся по способу получения (эталон, №2, №5, №6, АНКУ и раствор АНКУ ВТП), являются малотоксичными для клеток CEM SS: 50%-ная токсическая доза не была достигнута. Изучение антивирусной активности показало, что водорастворимые аддукты углеродных нанокла-стеров обладают невысокой ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-инфекции in vitro. 50% эффективная доза (ED50) этой группы препаратов находится в пределах 21,4 — 27,5 мкг/мл. Был обнаружен значительный вирулицидный эффект: все образцы способны инактивировать вирус, предотвращая заражение клеток-мишеней. Наиболее эффективным препаратом является легкая фракция АНКУ.

Ключевые слова: микробициды, ВИЧ-инфекция, нанокластеры углерода

ВВЕДЕНИЕ

Разработка эффективной вакцины для предотвращения ВИЧ-инфекции сможет снизить или элиминировать распространение ВИЧ/ СПИД. Несмотря на интенсивные исследования в течение последних 20 лет, эта цель пока не достигнута. Принимая во внимание увеличение количества новых случаев ВИЧ-инфекции среди женщин, особенно в развивающихся странах, создание топических микробицидов становится важным направлением среди мирового научного сообщества.

Микробициды — иммунобиологические препараты, гелевые или мазевые композиции, содержащие активные составляющие, способные предотвращать половую передачу ВИЧ и

Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16, НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития РФ. E-mail: allagilyazova@yandex.ru

других (или сопутствующих) инфекций, передающихся половым путем (таких, как гонорея, хламидиозы, генитальный герпес). Такие продукты предназначены, прежде всего, для женщин, которые могут пользоваться данным средством профилактики независимо от партнера.

Общее число микробицидов, находящихся на разных стадиях испытаний, составляет несколько десятков. К сожалению, клинические испытания III фазы большинства кандидатных микробицидов показали невысокую защиту от ВИЧ-инфекции. Таким образом, работы в этом направлении продолжаются, и разработка микробицидов остается актуальной, при этом особое внимание уделяется микробици-дам, обладающим более высокой эффективностью и продолжительностью действия.

В рамках данной работы мы провели исследование водорастворимых аддуктов нанокластеров углерода (АНКУ), активных в отношении штаммов ВИЧ-1, для разработки микробицидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки

Была использована Т-лимфобластоидная линия CD4+ клеток CEM-SS [1], полученная из коллекции Национального Института Здоровья (NIH, США). Данная линия представляет собой перевиваемую суспензионную клеточную культуру. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО2, в ростовой среде RPMI1640 (Sigma, США) с 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma, США), 2 мМ глютамина (Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения).

Вирусы

В работе использовали штамм HIV-1BRU — референс-штамм, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях.

Оценка цитотоксичности соединений

Цитотоксическое действие тестируемых препаратов оценивали, сравнивая жизнеспособность клеток в присутствии различных доз соединений с жизнеспособностью клеток без соединения. Клетки вносили в стерильный 96-луночный планшет в концентрации 300 — 500 х 103 и культивировали в присутствии разных доз соединений в течение 3 дней. Жизнеспособность клеток определяли подсчетом живых клеток в камере Горяева после окраски витальным красителем трипа-новым синим. 50%-ая цитотоксическая доза (TD50) — доза препарата, при которой 50% исследуемых клеток сохраняют жизнеспособность, — была рассчитана с помощью линейно-логарифмической интерполяции.

Оценка антивирусной активности

Клетки, чувствительные к ВИЧ, в течение 2 часов инкубировали при 37 °С с различными концентрациями соединений и затем заражали вирусом с множественностью заражения 100TCID50. После 24-часовой инкубации клеток с вирусом в присутствии препаратов ростовую среду заменяли на свежую.

На основании данных ИФА по оптической плотности (450 нм) определяли уровень инги-бирования инфекции в опытных образцах по отношению к контролю (без препарата). Расчет ED50 (50% эффективной дозы) проводили с помощью линейно-логарифмической интерполяции.

Исследование вирулицидного действия соединений

Изучение вирулицидного действия препарата проводили следующим образом: к вирус-содержащему стоку добавляли сухие навески или раствор препарата, создавая определенные концентрации. Затем инкубировали 20 — 30 мин при комнатной температуре, встряхивая на вортексе. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, осаждая агрегаты частиц. Полученный супернатант использовали для заражения клеток, чувствительных к ВИЧ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Аддукты нанокластеров углерода (АНКУ) представляют собой новые соединения углерода, обладающие высокой растворимостью в полярных растворителях, в т.ч. и воде. АНКУ разработаны в «НТЦ Прикладных нанотехно-логий» (Санкт-Петербург, Россия), получены в результате переработки каменно-угольных смол. Общая структурная формула аддуктов: [ОН]к-[С]п-(0ш02)т. Средний размер нанокластеров составлял 10—100 нм.

При изучении цитотоксических свойств клетки линии СЕМ ББ культивировали в присутствии разных концентраций соединений. Результаты этих исследований представлены на рисунке 1.

Все исследованные водорастворимые аддукты углеродных нанокластеров, различающиеся по способу получения (эталон, № 2, № 5, № 6, АНКУ и раствор АНКУ ВТП), являются малотоксичными для клеток СЕМ ББ: 50%-ная токсическая доза не была достигнута. При этом наименьшей токсичностью обладали препарат № 5 (натриевая соль АНКУ) и легкая фракция АНКУ (раствор АНКУ ВТП): жизнеспособность культивируемых клеток снижалась на 14,7 — 15,2% в присутствии концентраций 100 мкг/мл. Остальные препараты проявляли несколько большую токсичность, снижая жизнеспособность клеток на 20 — 37,4% по сравнению с контролем при тех же концентрациях.

Для изучения антивирусных свойств препаратов клетки СЕМ ББ заражали штаммом ВИЧ-1

Вш с множественностью инфекции 100 ТСГО50 и культивировали в присутствии различных концентраций препаратов. При этом было показано, водорастворимые аддукты углеродных нанокластеров обла-

Микробициды на основе нанокластеров

23

Эталон

№2

№5

И№6

АНКУ

0 Р-Р АНКУ

втп

Концентрация препарата, log мкг/мл

Рис. 1. Жизнеспособность клеток СЕМ ЯЯ, культивируемых в присутствии различных концентраций препаратов, выраженная в процентах от контроля клеток (М ± SD).

Таблица. Влияние препаратов АНКУ на ВИЧ-инфекцию.

А. Уровень активности инфекции* в присутствии различных концентраций препаратов. Оптическая плотность при 450 нм, данные ИФА р24 (М ± SD).

Препарат Концентрация, мкг/мл

100 10 1 0,1

Эталон 0,282±0,010 2,902±0,029 3,007±0,008 3,469±0,034

№ 2 0,203±0,008 2,903±0,036 3,136±0,011 3,480±0,034

№ 5 0,069±0,004 2,853±0,030 3,063±0,007 3,392±0,092

№ 6 0,182±0,009 2,920±0,057 3,098±0,018 3,500±0,000

АНКУ 0,178±0,010 2,537±0,023 2,895±0,010 3,473±0,022

Р-р АНКУ ВТП 0,219±0,007 2,903±0,006 2,962±0,035 3,179±0,059

* Средняя ОП для контроля инфекции составила 3,500±0,000, средняя ОП для контроля клеток составила 0,006±0,006.

Б. Уровень активности инфекции в присутствии различных концентраций препаратов, выраженный в процентах от контроля инфекции (М ± SD).

Препарат Концентрация, мкг/мл ED50, мкг/мл

100 10 1 0,1

Эталон 7,9±0,3 82,9±0,8 85,9±0,2 99,1±1,0 27,5

№ 2 5,6±0,2 82,3±0,2 89,6±0,3 99,4±1,0 26,3

№ 5 1,8±0,1 81,5±0,9 87,5±0,2 96,9±2,6 24,8

№ 6 5,0±0,3 83,4±1,7 88,5±0,5 100,0±0,0 26,6

АНКУ 4,9±0,3 72,4±0,7 82,7±0,3 99,2±0,6 21,4

Р-р АНКУ ВТП 6,1±0,2 82,9±0,2 84,6±1,0 90,8±1,7 26,8

дают невысокой ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-инфекции in vitro. Результаты представлены в таблице (А и Б). 50% эффективная доза (ED50) этой группы препаратов находится в пределах 21,4 — 27,5 мкг/мл.

Изучение вирулицидного действия углеродных нанокластеров проводили, добавляя

препараты к вирусному стоку. Полученным супернатантом инфицировали клетки СЕМ ЯЯ. В результате этого исследования было показано, что все образцы способны инак-тивировать вирус, предотвращая заражение клеток-мишеней (рис. 2). Наиболее эффективным препаратом является легкая фракция

Концентрация, мг/мл

Рис. 2. Вирулицидный эффект водорастворимых аддуктов нанокластеров углерода, выраженный в процентах от контроля инфекции (М ± SD).

АНКУ (раствор АНКУ ВТП): при добавлении 0,75 мг/мл препарата уровень инфекции снижается до 0%, а при добавлении 0,2 мг/мл — снижается на 98,5%. После инкубирования вирусного стока с каждым из остальных препаратов в концентрации 3 мг/мл уровень инфекции клеток составлял 0,3 — 0,9% от контроля инфекции (без препарата). Таким образом, для вирулицидного действия ЕБ50 для легкой фракции АНКУ (раствор АНКУ ВТП) составила < 0,2 мг/мл, а для остальных образцов < 1 мг/мл.

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие нанотехнологий привело к значительным успехам в области биоинженерии, молекулярной биологии, диагностики и терапии. Получение новых наноматериа-лов с помощью модификации поверхности, связывания с лигандами, полим

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком