ОКЕАНОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 3, с. 338-348
МОРСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.26
МИКРОБНОЕ НЕКУЛЬТИВИРУЕМОЕ СООБЩЕСТВО ДОННЫХ ОСАДКОВ ГЫДАНСКОЙ ГУБЫ И ЕНИСЕЙСКОГО ЗАЛИВА КАРСКОГО МОРЯ
© 2014 г. Е. В. Мамаева, М. Ю. Суслова, Т. В. Погодаева, В. В. Парфенова, Т. И. Земская
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск e-mail: elena_m@lin.irk.ru Поступила в редакцию 15.09.2012 г., после доработки 04.06.2013 г.
Методами молекулярной биологии (ПЦР, клонирование) исследовано разнообразие микроорганизмов в поверхностном слое донных отложений Гыданской губы и Енисейского залива Карского моря, различающихся по компонентному составу поровых вод и уровню минерализации. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК выявлены представители доменов Bacteria и Archaea.
Отмечено изменение состава сообществ микроорганизмов донных осадков по мере изменения градиента солености поровых вод. Как показал филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, состав микробных сообществ в южных частях заливов находится под влиянием пресноводного стока рек и ручьев из озер с водосбора, в северных — под воздействием морских вод. Полученные нами результаты указывают на присутствие в микробных сообществах донных осадков, бактерий способных использовать в качестве источника углерода широкий спектр субстратов, в том числе углеводороды, хлорорганические и ароматические соединения. Такие данные могут свидетельствовать как о присутствии загрязнений разного характера в осадках исследуемых районов, так и о потенциальной способности бактерий участвовать в деградации различных химических соединений, поступающих в воды и донные отложения Карского моря.
Б01: 10.7868/80030157414030083
ВВЕДЕНИЕ
Карское море характеризуется климатическими и гидрохимическими условиями, формирующимися под воздействием поступающих соленых вод частично из Баренцева моря, частично из Арктического бассейна, а также мощного пресноводного стока Оби и Енисея, годовой объем которого составляет более 40% всего стока пресной воды в Арктику [36]. Вместе с речной водой в Карское море поступают биогенные элементы, а также взвешенное и растворенное органическое вещество [13, 15, 20], большая часть которого осаждается вблизи прибрежной зоны [11]. В открытое море попадает лишь небольшой процент от всего поступающего со стоком органического вещества. Поэтому именно в зоне шельфа и эстуариях рек наиболее активно развиваются планктонные и бентосные водоросли и бактерии [4, 14].
Карское море считается олиготрофным из-за его низкой продуктивности, связанной с длительным ледовым покровом и долгопериоными отрицательными температурами воздуха и воды. С начала 20 века в Карском море проводятся периодические комплексные экспедиции [12, 25], в которых исследуется качественный и количественный состав микробных сообществ методами культивирова-
ния и микроскопии [2, 3, 6, 8, 9, 21, 22, 23], бактериальная первичная продукция [19], а также микробные процессы циклов метана и серы в водной толще и донных осадках [10, 16, 18]. Исследования разнообразия некультивируемых природных сообществ микроорганизмов методами современной филогенетики в Карском море ранее не проводились, хотя имеются публикации о таксономической структуре микробных сообществ районов Арктики и Антарктики [27, 29, 44, 45]. Такое состояние дел и определило цель нашей работы. А именно, изучение таксономического разнообразия микробного сообщества донных осадков заливов и шельфа Карского моря с помощью методов амплификации и клонирования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Район исследования. Исследования проводили в секторе Российской Арктики между 75° и 87° в.д. и с юга около 70° с.ш. Материалом для работы послужили пробы донных отложений, отобранные на 5 станциях на шельфе Карского моря, заливах Гыданском и Енисейском в ходе экспедиции на теплоходе "Советская Арктика" в августе-октябре 2009 г. (рис. 1).
75° с.ш.
- 70°
60° в.д. 70° 80° 88°
Рис. 1. Места отбора проб донных осадков.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пробы донных осадков отбирали гравитационной трубой (длиной 75 см) на станциях 13 и 17, и дночерпателем на станциях 7, 22 и 24. Поскольку измерений отдельных ионов на ст. 7 не прово-
дили, мы использовали данные химического состава поровых вод для расположенной рядом ст. 9 (таблица).
Отбор образцов проводили стерильно из срединной части керна, и затем, до момента исследования, пробы хранили в жидком азоте.
Поровая вода из образцов донных осадков была получена двойным центрифугированием при 10000 и 14000 об/мин. Измерения концентрации анионов и катионов в поровой воде осуществляли в соответствии с ранее описанными методиками [57].
Выделение суммарной ДНК из поверхностного слоя донных осадков проводили методом фенол-хлороформной экстракции [49]. Фрагменты гена 16S рРНК эубактерий и архей амплифицировали с использованием универсальных эубактериальных праймеров 500L (CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA) и 1350R (GACGGGCGGTGTGTACAAG). Амплификацию проводили на приборах "БИС" и "My Cycler", Bio-Rad в режиме: 94°С — 3 мин (1 цикл), 94°С — 45 с, 53°С — 45 с, 72°С — 60 с (30 циклов), 72° С — 2 мин (1 цикл). О наличии ампликонов и их молекулярной массе судили по результатам электрофоретического разделения в 1% агароз-ном геле. Амплифицированные фрагменты гена 16S рРНК были лигированы с использованием набора pGEM-T Easy Vectors ("Promega", США). Для получения рекомбинантов использовали компетентные клетки E. coli DH5-a. Трансформацию проводили методом, описанным ранее [40]. Отбор полученных клонов проводили методом "бело-голубого" скрининга. Колонии проверяли на наличие ожидаемой вставки амплификацией на праймерах 1F/1R ("Promega").
Характеристика районов Енисейского залива и Гыданской губы Карского моря
Стан- Координаты: Используемый пробоотборник Глубина водной толщи, м Минерализация в поровой воде из поверхностного слоя осадка, г/л Солевой состав поровых вод в поверхностном слое осадка, г/л
ции с.ш. в.д. НС O3 Cl— 2 — S O24 Na+ K+ Ca2+ Mg2+
7 73 °150' 80°274' Дч 25.0 —
9 73 °083' 79°981' БТ 23.0 30.0 0 17.5 2.3 8.3 0.5 0.2 1.0
22 72°557' 79°302' Дч 13.5 22.9 0 13.2 1.8 6.7 0.3 0.2 0.7
24 71°875' 82°823' Дч 9.5 0.3 0.06 0.1 0.02 0.06 0.006 0.01 0.004
13 71°776' 75°809' БТ 10.7 8.9 0 5.1 0.8 2.5 0.01 0.06 0.2
17 71°193' 77°459' БТ 4.5 0.1 0.06 0.03 0.007 0.03 0.006 0.003 0.002
Примечание. Дч — дночерпатель, БТ — бентосная трубка, прочерк — отсутствие данных. ОКЕАНОЛОГИЯ том 54 № 3 2014
Секвенирование клонированных фрагментов генов 16S рРНК проводили в Центре коллективного пользования "Геномика" СО РАН (г. Новосибирск). Для полученных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК ближайших гомологов находили с использованием поисковой программы BLAST сервера NCBI в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) [26]. Полученные последовательности на наличие химер проверяли в программе Pintail (http://www.biom-formatics-toolkit.org/Web-Pintail/). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit, для выравнивания последовательностей использовали алгоритм программы CLUSTAL W [http://www.genebee.msu.su/clustal]. Филогенетические деревья строили с использованием метода объединения ближайших соседей (neighbor-joining) на основе алгоритма Kimura two—parameters в программе MEGA версия 4.0 [51]. Показатель достоверности порядка ветвления определяли на основании "bootstrap" — анализа 100 альтернативных деревьев.
Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов гена 16S рРНК депонированы в базе данных GenBank под номерами JN203014 - JN203042, JN133442 -JN133497, JX413060 - JX413100, JX441119 -JX441299.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика химического состава поровых вод и донных осадков
Химический состав поровых вод и характеристики донных осадков представлены в таблице. Южные районы Гыданской губы (ст. 17) и Енисейского залива (ст. 24) по минерализации придонной воды можно отнести к пресным (0.1-0.3 г/л), а северные районы заливов (станции 13 и 22) и шельф Карского моря (ст. 7) - к морским (8.9-22.9 г/л), (30.7 г/л) [17]. Компонентный состав поровых вод на всех исследуемых станциях был одинаков, а концентрации отдельных ионов варьировали значительно (таблица).
Наименее минерализованы (0.1 г/л) поровые воды в поверхностном слое донных отложений южной части Гыданской губы (ст. 17). Концентрации сульфат-ионов равны 0.007, гидрокарбонат-ионов - 0.06, ионов натрия - 0.03 г/л. Поровые воды донных осадков южной части Енисейского залива (ст. 24) также опреснены, общая минера-
лизация составляет 0.3 г/л. Солевой состав и уровень концентраций основных ионов схож с таковыми на станции 17 (таблица). В северной части Гыданской губы (ст. 13) минерализация поровых вод достигает 8.9 г/л, увеличивается содержание сульфат-ионов до 0.8 г/л, возрастают значения хлорид-ионов, ионов магния, натрия (таблица). Значительное увеличение уровня минерализации поровых вод наблюдается в районе устья р. Енисей (ст. 22), где в поверхностном слое осадка она составляет 22.9 г/л, содержание хлорид-ионов равно 13.2, сульфат-ионов 1.8 и ионов натрия 6.7 г/л, соответственно (таблица). Под влиянием морских вод находятся станции 7 и 9, общая минерализация в поверхностном слое осадков этих станций достигает 30.7 и 31.7 г/л, соответственно. В поровых водах этих станций повышается концентрация сульфат-ионов до 2.3, хлорид-ионов до 17.5, ионов натрия до 8.3 г/л.
Анализ разнообразия и таксономический состав
библиотек клонов фрагментов гена 16БрРНК
В результате исследования суммарной ДНК из поверхностного слоя донных осадков пяти станций получена библиотека клонов, содержащая фрагменты гена 168 рРНК эубактерий и архей длиной до 900 пар нуклеотидов. Определено 375 нук-леотидных последовательностей, большая часть которых имеет высокий процент сходства (97-100%) с некультивируемыми микроорганизмами, выделенными из водной толщи и донных отложений морей, в том числе и холодноводных, а также из почв различных регионов мира. Для подтверждения таксономического статуса были построены филогенетические дере
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.