ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2004, № 7, с. 860-866
^ БИОЛОГИЯ
ПОЧВ
УДК 574.574.57.017:57.083
МИКРОБЫ-АНТАГОНИСТЫ (СТРЕПТОМИЦЕТЫ И БАЦИЛЛЫ), ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ПОЧВ РАЗНЫХ ТИПОВ
© 2004 г. В. И. Звенигородский1, А. И. Кузин1, Е. М. Шагов1, Р. Р. Азизбекян1, Г. М. Зенова2, Т. А. Воейкова1
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов. 113525, Москва, 1-й Дорожный пр., 1 2Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. 119899, Москва, Ленинские горы
Поступила в редакцию 03.09.2002 г.
Проанализированы почвы лесных, луговых и городских экосистем в отношении присутствия в микробном комплексе антибиотически активных стрептомицетов и бацилл. Создана коллекция почвенных стрептомицетов и бацилл (1031 изолят), выделенных из почв разных типов. Наибольшее количество культур, образующих антибиотики, выделено из дерново-подзолистой почвы, чернозема, дерновой, луговой и горной дерновой почв. Выявлены штаммы, эффективно подавляющие рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий и фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных растений. Создана модель для оценки инсектицидной активности изолятов и обнаружены штаммы, вызывающие летальный эффект на насекомых-вредителей - тараканов и сверчков, которые являются аналогами саранчи.
ВВЕДЕНИЕ
Спорообразующие микроорганизмы являются неисчерпаемым источником новых биологически активных веществ, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии и для защиты растений. Экономически ценные микроорганизмы могут служить основой для создания рентабельного производства средств защиты растений и продуктов сельского хозяйства, лекарственных препаратов для животных и человека. Следовательно, поиск и исследование новых свойств метаболитов микробиологического происхождения является актуальной задачей современной биологии.
Основной задачей настоящей работы был поиск стрептомицетов и бацилл, синтезирующих биологические вещества, активные против бактерий, грибов и насекомых. Существующие химические препараты, несмотря на высокую биологическую активность, обладают рядом недостатков: загрязняют окружающую среду, вызывают возникновение устойчивости у живых объектов, нарушают природные пищевые цепи.
В настоящее время описан ряд отечественных и зарубежных биологических средств борьбы с возбудителями болезней растений (Фитоспорин, Бактофит, Фитолавин, Триходермин Ж, Trichodex 20SP, Aspire, Biosave, Companion), однако их ассортимент и спектр биологического действия ограничены.
Некоторые вредные насекомые, наносящие значительные экономические потери, относительно устойчивы к традиционным химическим препаратам и существует необходимость созда-
ния альтернативных биологических инсектицидов. Поэтому в мире постоянно проводится работа по поиску новых продуцентов фунгицидных и энтомоцидных веществ. Препараты, созданные на основе продуктов микробиологического синтеза, экологически безопасны, безвредны и более легко разлагаются в окружающей среде. В связи с этим особый интерес представляет поиск споро-образующих штаммов бацилл и стрептомицетов, синтезирующих биологические вещества, активные против вредителей растений и насекомых, устойчивых к традиционным химическим агентам [6, 7]. Новизна работ заключается в выявлении природных штаммов бацилл и стрептомицетов с новыми антибиотическими активностями и широким спектром действия.
Цель работы состояла в выделении новых природных штаммов стрептомицетов и бацилл, синтезирующих биологические вещества, обладающие антибактериальным, фунгицидным, а также инсектицидным действием на насекомых-вредителей важных сельскохозяйственных растений.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили образцы почв, отобранные в разных регионах. Широкий спектр почв, расположенных в разных экосистемах, обусловлен целью исследования - выделение новых природных штаммов стрептомицетов и бацилл - продуцентов биологически активных веществ. Исследованы лесные, луговые, болотные
Таблица 1. Характеристика объектов исследования и число выделенных штаммов
Экосистемы Название почвы Район взятия образцов Число образцов Общее количество изолятов % изолятов от выделенных из всех почв
Лесные Глее-сильноподзолистая Архангельская обл. 1 16 1.6
Дерново-среднеподзолистая Московская обл. 4 30 2.9
Темно-серая лесная Тульская обл. 4 63 6.1
Дерново-среднеподзолистая Костромская обл. 1 8 0.8
Всего 10 117 11.4
Луговые, берег реки Дерновая луговая Луговая Архангельская обл. Тульская обл. 3 7 27 105 2.6 10.2
Горная дерновая Саяны, Алтайский край 9 96 9.3
Всего 19 228 22.1
Болотные Ил Крым 2 19 1.8
Берег моря Коричневая Крым, Абрау Дюрсо 2 17 1.6
Подзолисто-желтоземная Окрестности г. Сочи 4 68 6.6
Всего 6 85 8.2
Агроэкосистемы Дерново-среднеподзолистая окультуренная Московская обл. 11 124 12.0
Компост Тульская обл. 3 18 1.7
Дерново-среднеподзолистая окультуренная Костромская обл. 4 41 4.0
Дерново-среднеподзолистая окультуренная Владимирская обл. 6 68 6.6
Чернозем выщелоченный окультуренный Тульская обл. 6 69 6.8
Чернозем оподзоленный выщелоченный окультуренный Рязанская обл. 1 16 1.6
Чернозем выщелоченный окультуренный Тамбовская обл. 4 34 3.2
Всего 35 400 39
Городские экосистемы Урбанозем г. Москва г. Плес, Костромская обл. 4 1 54 12 5.2 1.5
г. Харьков, Украина 5 61 5.9
г. Гомель, Белоруссия 2 24 2.3
Анталия, Турция 2 31 3.0
Всего 14 127 12
Итого 86 1031 100
экосистемы, агроэкосистемы, городские экосистемы в разных почвенно-климатических зонах (табл. 1). Использовали смешанные образцы, составленные из двух, отобранных на расстоянии 1 м друг от друга на глубине 5-15 см от поверхности почвы.
Выделение микроорганизмов из почвы. Для выделения микроорганизмов из почвы использо-
вали традиционный метод поверхностного посева в модификации Звягинцева и Зеновой [2]. Образцы почвы высушивали при 50°С два часа для освобождения от неспорообразующих форм микроорганизмов. Затем 1 г образца почвы смешивали с 20 мл стерильной дистиллированной воды, энергично встряхивали и отстаивали при комнатной температуре 60-120 мин для осаждения крупных
частиц. После центрифугирования надосадочную жидкость рассевали в разведении 100-1000 раз для получения отдельных колоний на казеин-крахмальной агаризованной среде (ККА) следующего состава (г/л): гидролизат казеина ("Sigma", США) - 0.2; крахмал растворимый - 10.0; NaCl - 0.2; MgSO4 - 0.2; K2HPO4 - 0.5; CaCl2 - 0.05; FeCl3 - микродобавка, биотин ("Calbiochem", США) - 0.006; агар - 20.0; рН 7.0. Для ограничения роста грибов и немицелиальных бактерий и других микроорганизмов в среду добавляли (г/л): циклогексамид ("Koch-Light", Великобритания) -0.05; нистатин - 0.01 и налидиксовую кислоту ("Serva", США) - 0.02. Чашки инкубировали не менее 7 суток при 30°C. При рассеве одного образца почвы среди выросших колоний отбирали в среднем 15-16 различных по морфологии клонов (размер и цвет колонии, наличие и цвет пигментации, интенсивность споруляции, но не более 23 однотипных), петлей пересевали вновь на чашку с той же средой, с теми же добавками. Вторично выросшие колонии пересевали на скошенную среду ККА без добавок, присваивая номер образцу почвы и микробному изоляту (сквозной номер). Через 10 суток инкубации при 30°C чашки вторичного посева и косяки ККА хранили в холодильнике при +4°C.
Определение видовой принадлежности изолятов проводили по определителю Гаузе с соавт. [1] и определителю бактерий Берджи [4].
Культивирование микроорганизмов в жидкой среде. Выращивание выделенных микробных изолятов проводили в триптон-дрожжевом бульоне (ТДБ) следующего состава (г/л): бакто-трип-тон ("Difco", США) - 5.0; дрожжевой экстракт ("Difco") - 3.0; рН 7.2; в течение 5 суток в пробирках диаметром 20 мм на круговой качалке 220 об./мин при 30°C. Полученную культураль-ную жидкость (КЖ) анализировали на наличие в ней антибактериальной, фунгицидной, инсектицидной и протеолитической активности. Образцы КЖ хранили в 12% глицерине при -15°C.
Определение антибактериальной активности. В качестве тест-культур для оценки биоцидной активности были использованы микроорганизмы из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (ГосНИИгенетика). Грам-положительные бактерии - Micrococcus luteus АТСС 10240 (В-7845), Bacillus subtilis АТСС 15841 (В-4520); грамотрицательные бактерии - Escherichia coli K12W3350; дрожжеподобные грибы Candida albicans (Y-2401).
Для оценки антимикробной активности изолятов тест-культуры грамположительных и грамо-трицательных бактерий предварительно выращивали сутки при 37°C на пептонном агаре (ПА) следующего состава (г/л): пептон - 30.0; натрий
хлористый - 5.0; агар - 17.0. Штамм C. albicans выращивали сутки при той же температуре на агаризованной среде Ä следующего состава (г/л): пептон - 10.0; дрожжевой экстракт ("Difco") - 5.0; глюкоза - 20.0; агар - 17.0. Смыв культур с косяков проводили стерильным физиологическим раствором, полученную суспензию стандартизовали по оптической плотности 20 ед. и добавляли в расплавленную агаризованную среду того же состава из расчета 1 мл суспензии на 100 мл среды. Полученную смесь разливали по 12 мл в чашки Петри и после застывания на поверхность агара расставляли по 6 металлических цилиндров диаметром 10 мм на чашку. В цилиндры закапывали по 50 мкл культуральной жидкости испытуемых микробных изолятов, чашки инкубировали при 37°C в течение 20-24 ч и измеряли диаметр зон ингибирования роста тест-культур. Диаметры зон ингибирования менее 10 мм обозначены в таблицах как 0, то есть отсутствие биоцидной активности.
Определение фунгицидной активности. В качестве тест-культур использовали фитопатоген-ные грибы Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani и Sclerotinia sclerotiorum, вызывающие такие болезни культурных растений, как фузариоз картофеля и злаковых, корневую гниль хлопчатника и тыквенных, склеротониоз бобовых и подсолнечника. Штаммы грибов были получены из коллекции НИИ картофельного хозяйства.
Оценку фунгицидной активности выделенных штаммов проводили микробиологическим методом. Для этого культур
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.