ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 8, с. 863-869
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.07
МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ
© 2015 г. А. В. Николаев*, Л. А. Карцова**, 1, В. В. Филимонов*
*Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук
194021 Санкт-Петербург, Политехническая ул., 26 **Санкт-Петербургский государственный университет, Институт химии 198504 Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский просп., 26 1Е-таИ: kartsova@gmail.com Поступила в редакцию 03.03.2014 г., после доработки 18.11.2014 г.
Разработана микрофлюидная система для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием. Описан процесс изготовления чипа на основе полидиметилсилоксана и стекла для определения электроактивных соединений. Изучены возможности обработки поверхности канала чипа в газовом разряде, додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия, ионной жидкостью хлоридом 1-додецилтриметилимидазолия, используемыми в качестве добавок к рабочему буферному электролиту. Выявлены возможности использования разработанной микрофлюидной системы для определения полифенольных антиоксидантов в зеленом чае и красном вине.
Ключевые слова: микрофлюидные системы, капиллярный электрофорез, амперометрическое детектирование, полифенольные антиоксиданты.
Б01: 10.7868/80044450215060122
Число разработок по микрофлюидным аналитическим системам (МФАС) активно растет. Достоинства МФАС заключаются в экспрессности, малом расходе образцов и реагентов, портативности аппаратуры и сравнительной простоте ее изготовления [1—3]. Одним из первых методов анализа, переведенных в микроформат, стал капиллярный электрофорез (КЭ). Традиционные варианты детектирования в капиллярном электрофорезе на чипах — ультрафиолетовое, флуориметрическое, масс-спек-трометрическое и электрохимическое (ЭХ).
Наше внимание сконцентрировано на последнем варианте, характеризующемся высокой чувствительностью, простотой реализации и сравнительно низкой стоимостью [4]. Капиллярный электрофорез в чип-формате с электрохимическим детектированием получил достаточно широкое распространение за рубежом, однако в России практически не изучен, и в настоящее время отечественных микрофлюидных систем КЭ с ЭХ-детектиро-ванием нет.
Огромное внимание в последние годы уделяется определению полифенольных антиоксидан-тов в биологических жидкостях, пищевых продуктах, БАДах. Полифенолы подавляют действие свободных радикалов, взаимодействуют с ионами тяжелых металлов, предупреждая их участие в окислительных процессах, обладают радиопро-
текторными свойствами [5]. Использование микрофлюидных систем, обеспечивающих экспрессное определение этих аналитов, открывает новые возможности.
Цель исследования — разработка микрофлюидного чип-анализатора (МФЧА) с электрохимическим детектированием и выявление его аналитических возможностей при определении электроактивных аналитов — катехинов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Оборудование. Микрофлюидный чип-анализатор представляет собой систему, состоящую из чипа для капиллярного электрофореза, помещаемого в аналитическую установку [6]. Аналитическая установка содержит высоковольтный источник, амперметр, блок управления подачи напряжения на электроды, блок для связи устройства с компьютером.
Аппаратура для изготовления чипов: установка для вакуумного напыления материалов; устройство совмещения и экспонирования ЭМ-576; автомат нанесения фоторезиста О8ФН-125/200-004; мембранный насос с отрицательным разряжением 75 кПа; сушильный шкаф-термостат; микроскопы МЕТАМ Р-1 и микроскоп ОГМЭ-П2; форвакуум-
ный насос с производительностью 42 л/мин и остаточным давлением 2 Па.
Аналитическое оборудование: система капиллярного электрофореза Капель 105 М со спектро-фотометрическим детектором (190—380 нм) (НПФ "Люмэкс", СПб); кварцевый капилляр внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 50 см (максимальное напряжение 25 кВ); аналитические весы Shimadzu AUX 220; рН-метр лабораторный производства Hanna Instruments; система очистки воды Millipore Simplicity UV; микродозаторы переменного объема BIOHIT (5-50, 50-200, 2001000 мкл); пробирки для микропроб Эппендорфа полипропиленовые емк. 1.5 мл (Медполимер, СПб); фильтры ацетатно-целлюлозные (d = 1 см), стекла предметные (26 х 76 мм).
Реактивы. Использовали фоторезист S1813 (Shipley), эластомер Sylgard 184-A (Dow Corning), сшиватель Sylgard 184-B (Dow Corning); (NH2)2CS х. ч.; K4[Fe(CN)6]3 х. ч.; Na2S2O3 х. ч.; 10 мМ водный раствор AgNO3.
Для приготовления растворов и буферных электролитов применяли деионизированную воду (18 мОм см); NaOH х. ч., 0.1 M HCl, Na2HPO4 х. ч., NaH2PO4 ■ 2H2O х. ч., Na2B4O7 ■ 10Н20 х. ч., 30%-ную H2SO4 х. ч., NH4F х. ч., KCl х. ч., ацетон ч. д. а., диметилсульфоксид х. ч., этанол х. ч., доде-цилсульфат натрия (ДДСН) ч. д. а. (Реахим), хлорид 1-додецил-3-метилимидазолия (Sigma).
Стандартные образцы полифенолов - кате-хин, эпикатехин (ЭК), эпикатехин галлат (ЭКГ), эпигаллокатехин (ЭГК), эпигаллокатехин галлат (ЭГКГ) фирмы Sigma; пирокатехин х. ч., резорцин х. ч., гидрохинон х. ч., фенол х. ч. фирмы Нева Реактив.
Изготовление чипа описано ранее [6] и включает следующие этапы: изготовление кремниевой матрицы для формования полимерной части чипа; формование полимерной части чипа из поли-диметилсилоксана (ПДМС); изготовление золотых электродов на предметное стекло; совмещение полимерной и стеклянной частей.
Поверхность каналов в разряде обрабатывали с использованием генератора плазмы, представляющего собой герметично закрывающуюся камеру, из которой откачивали воздух форвакуум-ным насосом, и два электрода внутри камеры. Между электродами зажигали тлеющий разряд. Сначала в камеру помещали стеклянную подложку, а через 30 мин ПДМС. Окисление ПДМС проводили в течение 2 мин. После обработки покровную пластину из ПДМС и стеклянную подложку с электродами совмещали, что приводило к необратимому склеиванию частей.
При динамической модификации сепараци-онного канала готовили растворы ПАВ (ДДСН, дезоксихолат натрия и ионную жидкость хлорид
1-додецил-3-метилимидазолия) различных концентраций (1, 2, 4 мМ) в 20 мМ боратном буферном электролите (pH 9.2), которые в дальнейшем использовали в качестве рабочего буферного раствора. Каналы чипа гидродинамически промывали полученными растворами перед проведением анализа в течение 30 мин при скорости потока 1 мкл/мин.
Для изготовления хлоридсеребряного электрода сравнения электроосаждали серебро на электроды из растворов AgNO3 при подаче постоянного отрицательного потенциала на модифицируемый электрод. Скорость осаждения контролировали по величине тока, при этом плотность тока через поверхность электрода не превышала 50 мА/см2. При электроосаждении в сепарационный канал собранного чипа гидродинамически вводили электролит с осаждаемым металлом (10 мМ AgNO3), модифицируемый электрод подключали к отрицательному полюсу источника питания, положительный электрод от источника помещали в резервуар сброса пробы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На основании анализа литературных данных по разработке микрофлюидных чипов для КЭ—ЭХ [7] выбрали вариант гибридного чипа, представляющего собою стеклянную подложку с микроэлектродами и пленку из ПДМС с системой микроканалов. Конфигурация чипа представлена на рис 1. В ходе работы применяли электрокинетический вариант ввода пробы. Резервуары 1, 3 и 4 заполняли буферным электролитом. Резервуар 2 заполняли раствором пробы. Далее на электроды в резервуарах 2 и 3 подавали высокое напряжение (120 В). Затем с электродов в резервуарах 2 и 3 напряжение снимали, а на электроды в резервуарах 1 и 4 подавали сепарационное напряжение. Каналы разделения и ввода пробы готовили непосредственно в слое полимера, а золотые электроды детектора — на стеклянной подложке. Толщина электродов составила 320 ± 20 нм.
Выбор ПДМС обусловлен высокой воспроизводимостью получения элементов микронного масштаба при высококачественном формовании реплик [8], кроме того, полимеризацию проводят при сравнительно низких температурах, материал не токсичен, химически инертен.
Сборку чипов — процесс соединения полимерного слоя со стеклянной пластиной — проводили вручную. При выборе взаимного расположения электродов детектора важно было не препятствовать массопереносу, обеспечить минимальное уширение зон аналитов и изоляцию электрохимической ячейки от сепарационного напряжения (~100-300 В/см) [9].
В работе [6] выявлены возможности двух конфигураций: off-channel и in-channel. Лучшие результаты
Сечение рабочего канала 35 мкм
п \
/ 20 мкм \ / о0 мкм \ 65 мкм
Рис. 1. Схема резервуаров и каналов микрофлюидного чипа и сечение рабочего канала.
(а)
10 мкм М ^
(б)
50 мкм
Вспомогательный электрод
Рабочий электрод
Электрод сравнения
Вспомогательный электрод
Электрод сравнения
Сливной резервуар
Катод
достигнуты при расположении электродов перпендикулярно полю высоковольтного источника (электроды параллельны потоку электролита — двухэлек-тродная конфигурация in-channel), так как в этом случае влияние высоковольтного источника на ток в ячейке минимально.
Поскольку трехэлектродная ячейка обладает лучшими параметрами по сравнению с двухэлек-тродной [10], в данной работе были изготовлены чипы с тремя электродами. Вспомогательный электрод расположили за электродом сравнения и рабочим электродом (рис. 2). Применение трех-электродной ячейки позволило увеличить соотношение сигнал/шум в сравнении с двухэлектродной в 3 раза. Для получения хлоридсеребряного электрода сравнения выполняли гальваническое осаждение серебра на золотую поверхность, после чего его электрохимически хлорировали из 0.1 М HCl. В процессе анализа необходимо поддерживать постоянную концентрацию хлорид-ионов.
Поскольку ПДМС — гидрофобный материал, каналы трудно смачиваются водными растворами, на стенках могут адсорбироваться гидрофобные вещества и легко образуются пузыри даже в сильно разбавленных буферных растворах. Такая поверхность не может давать стабильного электроосмотического потока. Существуют различные способы модификации поверхности ПДМС [11—14]. В данной раб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.