ИА
микроРН ГНОСТИК
\
Доктор биологических наук Николай КОЛЕСНИКОВ, ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук Сергей ТИТОВ, научный сотрудник, академик Игорь ЖИМУЛЕВ, директор, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН (Новосибирск)
Выявлять рак на самых начальных его стадиях — одна из важнейших задач практической медицины: чем раньше это удается, тем больше шансов на излечение. Недавнее открытие нового класса молекул РНК — микроРНК (миРНК) — совершило переворот в наших представлениях о регуляторном потенциале генома и повлекло за собой разработку новых подходов в ранней диагностике онкологических заболеваний. Эти молекулы можно использовать в качестве биомаркеров, помогающих ответить на многие вопросы, в том числе
о вероятности развития того или иного типа рака, прогноза рецидива и т.д. Потенциально они могут стать основой и терапевтических средств.
Рак — очень сложное заболевание, к тому же сопровождающееся высокой летальностью. По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно в мире от него погибают более 7,5 млн человек. В России на начало 2011 г. на учете в онкологических учреждениях состояли свыше 2,6 млн пациентов, а к концу того же года уже 2 900 629, т.е. 2,0% населения страны. Каждый третий раковый больной
умирает в течение года после постановки соответствующего диагноза, поскольку злокачественные новообразования в 60% случаев выявляются на Ш—ГУ стадиях развития, когда эффективное лечение уже затруднительно.
Но рак — не приговор, с ним можно и нужно бороться, и при современном уровне медицины он излечим. Главная задача — научиться распознавать зло-
качественное перерождение клеток на самых ранних стадиях. К сожалению, существующие традиционные методы диагностики этого не позволяют. Поэтому во всем мире ведут поиск более эффективных подходов к решению данной проблемы на основе передовых технологий молекулярной биологии*. Прорыв в этом направлении наметился с недавнего открытия ранее неизвестного класса малых некодирующих молекул РНК — микроРНК (миРНК), которые «дирижируют» множеством биологических функций. К настоящему времени показано, что дерегуляция экспрессии отдельных микроРНК или их групп, проще говоря, сбой в их «работе» ведет к патологическим состояниям, в том числе и к онкологическим заболеваниям человека.
«МАЛЫЕ, НО УДАЛЫЕ»
Напомним, существуют несколько классов РНК-молекул, отличающихся не только структурой, размерами, но и выполняемыми в клетке функциями. Так, информационные РНК (иРНК) служат посредниками, переносящими «сообщения» из ядра в цитоплазму, а, например, рибосомальные РНК (рРНК) регулируют основные этапы белкового синтеза. По сравнению с этими молекулами интересующие нас миРНК значительно меньше по своим размерам, состоят из одной цепочки, насчитывающей ~ 22 нуклео-тида. Кодируются они небольшими участками ДНК и выявлены в геномах животных, растений и вирусов. Так, у человека обнаружено уже 1600 генов миРНК, способных в целом контролировать работу 60% бе-лок-кодирующих генов. Свою функцию — регулировать экспрессию последних на транскрипционном и посттранскрипционном** уровнях — молекулы миРНК выполняют посредством комплементарного взаимодействия с участками матричной РНК, что приводит к выключению соответствующих генов.
МикроРНК были открыты профессором Университета штата Массачусетс (США) Виктором Амбросом в 1993 г. у нематоды (круглого червя) как гены, участвующие в регуляции процессов развития, однако сразу не были оценены по достоинству. Но уже в 2001 г. молекулу микроРНК, по версии журнала Science, признали «молекулой года»*** (заметим, что в том же году мировой научной общественности был представлен черновой вариант расшифровки генома человека). Открытие нового класса молекул РНК привело к обнаружению «темной» части генома, мизерной по занимаемому месту (всего 0,001% генома), но зато играющей ведущую роль в процессах регуляции как в отдельной клетке, так и на уровне организма в целом.
*См.: Ф. Киселев. Новое в молекулярной диагностике рака. — Наука в России, 2008, № 1 (прим. ред.).
"Транскрипция — процесс копирования генетической информации с молекулы ДНК на РНК, в частности на информационную (или матричную) РНК (иРНК или мРНК), содержащую информацию о первичной структуре (аминокислотной последовательности) белков (прим. ред.).
***В 2008 г. Виктор Амброс, профессор генетики Гарвардского университета (США) Гэри Рувкун и профессор ботаники Кембриджского университета (Великобритания) Дэвид Болкомб за исследования микроРНК были удостоены престижной премии Альберта Ласкера в области биомедицинских наук (прим. ред.).
Схема миРНК-146, вовлеченной в регуляцию иммунной системы и воспалительных процессов. Разными цветами обозначена степень консерватизма нуклеотидной последовательности, в частности, красным — наиболее консервативные нуклеотиды, т.е. сохраняющиеся неизменными на протяжении миллионов лет эволюции.
Схема детекции миРНК с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени у одного пациента. RFU (Relative Fluorescent Unit) — относительные единицы флуоресценции; U6 — малая РНК, используемая как маркер, по отношению к ней определяют уровень исследуемых миРНК; ревертирование — химическая реакция построения обратной цепи ДНК по РНК; кДНК — комплементарная ДНК, синтезированная по мРНК.
МиРНК служат «глобальными переключателями» генома, координированно контролируя множественные метаболические пути от момента зарождения организма. Как выяснилось, в одной клетке экспрес-сируются более 1000 миРНК. Многочисленные данные однозначно свидетельствуют о критической роли этих молекул в ключевых процессах эмбрионального развития, пролиферации и дифференцировки клеток, старения, иммунном и стрессовом ответах. Дальнейшие исследования показали: миРНК могут выполнять роль не только посттрансляционных негативных регуляторов, т.е. «выключателей» генной активности, но, возможно, и активаторов транскрипции и трансляции*.
Дерегуляция, т.е. сбои миРНК (по сравнению с нормой), наблюдается при различных заболеваниях, в том числе онкологических. Множество экспериментов свидетельствует в пользу того, что каждый
*Трансляция — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (мРНК) (прим. ред.).
миРНК
N111111
Шаг 1:
Ревертирование с длинного праймера
I
О
Праймер для ревертирования
ЕМ I 1111 ЕМ I иМИ
кДНК
О
Флуоресцентно-меченый зонд
Увеличение
2500 2000
1500 Условная норма
1000
зоо
0 ¿¿у
10
20 30 Циклы
4С
яз
1ТПР146 п\\R22^
ие
Увеличение
2500 2 ООО 1500 Т00О 600 о
Опухоль / х
///
ю
20 30 Циклы
40
ю
тип опухолей характеризуется уникальным набором миРНК, своеобразным штрих-кодом, который можно выявить чувствительными методами, базирующимися на полимеразной цепной реакции (ПЦР). С другой стороны, показано: несмотря на то, что типов рака насчитывается около 250, существуют как «специфические», так и «общие» миРНК — дерегуляция последних зарегистрирована во всех типах злокачественных клеток. В настоящее время идентифицировано 84 таких «общих» молекул, относящихся к «онкомиру», вовлеченному в канцерогенез, а профили их экспрессии предположительно коррелируют с диагнозом, стадией, прогрессией опухоли или прогнозом развития различных раковых заболеваний. Кроме того, последние исследования показали, что микроРНК не только ассоциированы с различными типами опухолей, но могут сами выступать в роли онкогенов и супрессоров новообразований, т.е. быть первопричиной злокачественных превращений наряду с соматическими мутациями в генах.
Есть еще два фактора, делающих миРНК привлекательными для дальнейших исследований. Первый носит практический характер и связан со стабильностью миРНК (в отличие от мРНК), позволяющей выделять их не только из биообразцов (операционный материал, биологические жидкости), но и из фиксированных препаратов, что открывает широкие возможности для сравнительного анализа. Второй фактор связан с обнаружением циркулирующих в кровяном русле стабильных миРНК, находящихся в свободном состоянии, т.е. вне клетки. Более того, продемонстрировано, что раковые клетки высвобождают миРНК — их можно обнаружить в плазме или сыворотке крови в составе экзосом (внеклеточных структур, гетерогенных по составу веществ). Впрочем, роль циркулирующих в крови миРНК, выделяемых раковой клеткой, еще не выяснена до конца. Открыт и вопрос, являются ли такие молекулы продуктом распада после гибели злокачественных клеток или происходит активная секреция послед-
БО з =
X
I ^
I
О
0
1 ^
15 :и
и
I ■■
Коллоидный узел
Папиллярный рак
гтнК-221 гшК-222 т1И-205
Сравнение уровней экспрессии миРНК при папиллярном раке и коллоидном узле щитовидной железы.
ними специфических миРНК в ходе межклеточной коммуникации? В поддержку второго предположения говорят результаты экспериментов, связанных с поиском методов ранней неинвазивной диагностики онкологических заболеваний на основе выявления в плазме или сыворотке крови специфических онко-микроРНК для определенных видов рака.
Таким образом, полученные к настоящему времени данные позволяют рассматривать миРНК в качестве идеальных биомаркеров (стабильность, тканеспеци-фичность, количественное измерение) для выявления разных злокачественных образований, прогноза их развития, эффективности терапевтического лечения, а также в качестве мишеней потенциального воздействия на опухолевые процессы. Правда, приходится констатировать, что экспериментальные работы по этому направлению достойно финансируются и интенсивно развиваются в основном за рубежом. В нашей стране они единичны как в учреждениях РАН, так и РАМН.
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
Выяснение роли микроРНК в канцерогенезе и разработка подходов к их использованию в качестве диагностических биомаркеров при онкологических заболеваниях человека — таковы направления исследований, развиваемых в настоящее время в Институте молекулярной и клеточной биологии СО РАН. Проводим их в тесном сотрудничестве с ЗАО «Век-тор-Бест», медицинскими учреждениями Новоси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.