ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 9, с. 1088-1092
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.174.015.3:597.5
МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КУНДЖИ Salvelinus leucomaenis
САХАЛИНСКОЙ ОБЛАСТИ
© 2013 г. К. И. Афанасьев, Г. А. Рубцова, Е. Г. Шайхаев, Л. А. Животовский
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: levazh@gmail.com Поступила в редакцию 14.01.2013 г.
Разработана панель 12 полиморфных микросателлитных маркеров для популяционно-генетиче-ских исследований кунджи Salvelinus leucomaenis. Исследованы четыре выборки, каждая объемом 48 особей, из географически различных мест: островов Сахалин, Кунашир и Итуруп (2 выборки). Общее число различных по размерам аллелей в разных локусах варьировало от 2 до 31. Аллельное разнообразие и ожидаемая гетерозиготность популяции кунджи с сильным антропогенным давлением оказались ниже, чем для диких популяций этого вида. Выявлена значительная генетическая подразделенность различных островных популяций кунджи, соответствующая модели изоляции расстоянием.
DOI: 10.7868/S0016675813090026
Кунджа Salvelinus leucomaenis (Pallas) — вид гольцов, обитающий в азиатской части бассейна Тихого океана. Его ареал включает бассейны Охотского и северной части Японского морей, а также азиатское побережье Тихого океана на юг от Олюторского залива до о-ва Хонсю [1]. Таксономическое положение, фенетическое разнообразие и основные особенности биологии этого вида подробно рассматриваются в обзоре Савваи-товой с соавт. [2]. Отмечается, что хотя, по сравнению с другими видами гольцов кунджа характеризуется меньшим морфологическим и экологическим разнообразием, у нее встречаются почти все известные для гольцов внутривидовые формы. Все это дает основание предполагать наличие внутривидовой генетической дифференциации этого вида. И действительно, в ряде работ японских исследователей была показана географическая изменчивость гемоглобина, изозимов и ми-тохондриальной ДНК кунджи [3—5]. Однако, учитывая то, что в настоящее время при установлении популяционно-генетической структуры наиболее информативны микросателлиты [6—8], представляется интересным изучить генетическую дифференциацию кунджи с использованием именно этих маркеров. Начало работ по мик-росателлитной изменчивости этого вида положено японскими исследователями, изучившими кунджу Японских островов по пяти локусам [9]. Популяции кунджи, приуроченные к российской части ареала, остаются совершенно неизученными. Кроме того, важно вовлечь в анализ большее число маркеров в целях увеличения разрешающей способности и идентификационной мощно-
сти популяционного исследования. Целью нашей работы явилась разработка системы микросателлитных маркеров для исследования популяцион-ной структуры кунджи, обитающей на территории России, и анализ ряда выборок в целях оценки внутри- и межпопуляционной изменчивости этого вида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе проанализировано 192 образца из четырех популяций кунджи различных водоемов Сахалинской области: р. Виахту (северо-западный Сахалин, июнь—июль 2010 г., производители), оз. Валентины (о. Кунашир, 14—15 октября 2010 г., производители), оз. Благодатное (о. Итуруп, 14 октября 2008 г., производители), руч. Курильский (приток р. Курилка, о. Итуруп, 2 июля 2009 г., молодь) (рис. 1). Из каждой выборки было взято для ДНК-анализа по 48 образцов.
Для исследования были подобраны 12 микросателлитных локусов, из которых три (81г4, 81в5, Б1г6) разработаны именно для кунджи [9], а девять локусов были ранее описаны для других видов лососевых рыб (табл. 1).
Используемая нами методика генотипирова-ния микросателлитных локусов требует небольших размеров амплифицируемых фрагментов ДНК (не превышающих 250 пн), поэтому для пяти локусов с большими размерами аллелей были сконструированы новые праймеры, позволившие
МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КУНДЖИ
1089
уменьшить размеры ПЦР-продукта (в табл. 1 эти локусы помечены звездочками):
One109 F : GAGAGGGAGAGAGTGTCTTTG
R : GTAGCATCAGCTCACTAATGGGATAATA; Sle6 F : TTTCATGATATTTGGAGGCACTGAT
R : CCCTGTGACAGTGTGTCAGTAA; Sle5 F : GATGCCAGCACTGAGGTTGAAT
R : CGAAATAAAGGGTGAAGGGAGTAA; Sle4 F: ACAAGACAGGGGGCACACTAAT
R : ATCATGCAGAGCAGAGGGTTCTTA; SnaMSU01 F : AACACAAAGTGTCTAGGTGAC R : AACAGGTGTCAGAGCATGTGT.
Образцы ткани для ДНК-анализа (небольшой кусочек грудного плавника) фиксировали в 96%-ном этаноле. Выделение тотальной ДНК проводили стандартным методом с использованием набора реагентов Diatom DNA Prep 200 фирмы "ИзоГен" (Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе MJ Research PTC-100 с использованием готовых лиофи-лизированных смесей для ПЦР Gene Pak PCR Core фирмы "ИзоГен" (Россия) с добавлением 5 мкл смеси праймеров (конечная концентрация 0.5 мкМ) и 5 мкл геномной ДНК (100 нг). Продукты амплификации фракционировали с помощью электрофореза в 6%-ном неденатурирующем по-лиакриламидном геле в 0.5 х TBE буфере при напряжении 300 В в течение 2—5 ч. Полученные фо-реграммы окрашивали бромистым этидием и документировали в ультрафиолетовом свете. В качестве маркеров длин фрагментов использовали ДНК плазмиды pBR322, обработанные ре-стриктазами HaelII и HpalI. Размеры аллелей по каждому локусу определяли с использованием программы 1D Image Analysis Software Version 3.5 фирмы "Кодак" (США).
Для оценки аллельной изменчивости, индекса фиксации, уровня значимости p при тестировании соответствия распределению Харди—Вайн-берга и расчета коэффициентов попарного сходства популяций 0 (оценки /'¿•^статистики) использовали программу GDA (Lewis, Zaykin, 2001) в соответствии с руководством Вейра (Weir, 1996).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Все исследованные нами микросателлитные локусы кунджи оказались полиморфными: число различных по размеру аллелей в объединенных выборках варьировало от 2 (в локусах Smm21 и Ssa20.19) до 31 в локусе Sle4 (табл. 2). Некоторые локусы с небольшим числом аллелей оказались мономорфными в ряде выборок (табл. 2). Распределение частот генотипов находится в равновесии по Харди—Вайнбергу по всем локусам во всех вы-
Рис. 1. Локализация мест взятия проб. 1 — р. Виахту, 2 — оз. Валентины, 3 — оз. Благодатное, 4 — руч. Курильский.
борках (уровни значимости превышают 0.05), за исключением локусов Ssa197 в выборке из оз. Благодатное (p = 0.023) и SnaMSU01 у кеты оз. Валентины (p = 0.011); однако на уровне 0.01 отклонения незначимы, тем более они незначимы при введении поправки Бонферрони на множественные выборки.
Различные популяции отличаются друг от друга по генетическому разнообразию. Минимальное внутрипопуляционное разнообразие отмечено у кунджи руч. Курильский как по среднему числу аллелей (поправку на объем выборки не делали из-за практически одинакового числа гено-типированных особей), так и по ожидаемой гете-розиготности (табл. 2). Это, вероятно, связано с сильным антропогенным давлением на эту попу-
Таблица 1. Характеристика исследованных микросателлитных локусов кунджи
Локус Повторяющаяся последовательность Температура отжига, °С Интервал аллельных размеров Источник информации и "родной" вид*
Оту 301 (СА)п 50 62-80 [10], микижа
Жотт3 (CA)nCG(CA)n 51 114-124 [11], мальма
Бтт5 (СА)пС(СА)п 52 80-100 Там же
8тт 17 (СА)п 51 111-131 »
Smm21 (ТС)пТТТС(ТС)п 54 113-129 »
Ssa197 ^Т)пС^)пТС^)пА (GTGA)n 52 114-126 [12], семга
&а20.19 (АС/ГО)п 51 81-91 [13], семга
0пе109** (TAGA)n 56 88-156 [14], нерка
Бк6** (СА)п 50 85-99 [9], кунджа
Бк5** (GCGT)n(GT)n 53 102-148 Там же
Бк4** (СА)п 53 106-140 »
БпаМБ1101** ^АСА)п 50 76-184 [15], речная форель
* "Родной" — это вид, для которого была разработана данная пара праймеров. ** Локусы с модифицированными праймерами, уменьшающими размер ПЦР-продукта.
ляцию. Действительно, в течение многих десятков лет эта популяция подвержена стрессу, поскольку находится вблизи поселка и интенсивно облавливается рыбаками-любителями. Кроме того, руч. Курильский впадает в водоток, в который выпускается молодь горбуши и кеты с рыбоводного завода "Курильский"; ранее популяция кун-джи здесь подвергалась прореживанию для снижения потерь заводской рыбы из-за хищничества. Остальные три популяции кунджи гораздо меньше подвержены направленному антропогенному давлению. Таким образом, предложенная
ручей Курильский
Рис. 2. Бескорневое дерево исследованных популяций кунджи.
панель микросателлитных локусов способна выявить тренды генетического разнообразия популяций, в том числе связанные с деятельностью человека.
Обследованные популяции кунджи значительно дифференцированы друг от друга. Значения 0, рассчитанные для всех выборок, лежат в пределах от 3.1% (локус 81в4) до 19.0% для Бтт3 (табл. 2). Усредненное по всем выборкам и локусам значение 0 равно 8.0% с 95%-ным доверительным буд-стреп-интервалом [5.8, 10.3]. На бескорневом дереве (рис. 2) видно, что выборки располагаются в соответствии с их географической удаленностью друг от друга. Наиболее сближены выборки в пределах географически небольшого района — из озера Благодатного и ручья Курильского (о. Итуруп): значение 0 для них равно 1.9%, что статистически значимо с 95%-ным доверительным будстреп-интервалом [0.87, 2.8]. Популяции кун-джи из водоемов соседних островов (Итурупа и Кунашира) подразделены сильнее, чем популяции в пределах одного острова, поскольку они более удалены и репродуктивно более изолированы друг от друга: среднее значение 0 для них равно 4.4%. Еще большие генетические отличия от остальных исследованных популяций характеризует кунджу более удаленной р. Виахту (о. Сахалин), дифференциация которой от кунджи Южных Курил в величинах 0 достигает 12.0%. В данном случае четко прослеживается модель изоляции расстоянием, выявляемая нашей панелью маркеров: чем сильнее репродуктивная изоляция, тем значительней генетическая дифференциация по нейтральным и слабоселективным маркерам, каковыми в основном и являются микросателлиты.
МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КУНДЖИ 1091
Таблица 2. Изменчивость популяций кунджи по микросателлитным локусам
Выборка Общее число различных по размеру аллелей 9 (%), индекс межпопуля-ционной дифференциации
Локус Параметры р.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.