УДК 577.3+578.61
МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЛИПИДНАЯ ПОРА В МЕХАНИЗМЕ ГЛУТАМАТ-ИНДУЦИРУЕМОЙ КАЛЬЦИЕВОЙ ДИСРЕГУЛЯЦИИ
НЕЙРОНОВ МОЗГА
© 2011 г. Г. Д. Миронова1, 2, К. Н. Белослудцев1, А. М. Сурин3, А. С. Трудовишников1, Н. В. Белослудцева1, В. Г. Пинелис4, И. А. Красильникова4, Б. И. Ходоров3
Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ул. Институтская, д. 3, г. Пущино, Московская обл., 142290; электронная почта: mironova40@mail.ru 2Пущинский Государственный университет, проспект Науки, д. 3, г. Пущино, Московская обл., 142290 3НИИобщей патологии и патофизиологии РАМН, ул. Балтийская, д. 8, г. Москва, 125315 4Научный Центр здоровья детей РАМН, Ломоносовский проспект, д. 2/62,
г. Москва, 119991 Поступила в редакцию 31.05.2011 г.
Продолжительная стимуляция нейронов центральной нервной системы глутаматом (Glu) приводит к нарушениям Са2+ гомеостаза и функций митохондрий, завершающимся гибелью нервных клеток. В работе был изучен один из начальных этапов в механизме гибели нейронов при стимуляции ионо-тропных глутаматных рецепторов. С этой целью была исследована роль эндогенных свободных жирных кислот (СЖК), образующихся в результате Glu-индуцированной активации фосфолипазы А2 (PLA2), в возникновении отсроченной Са2+ дисрегуляции (ОКД) и синхронной с ней глубокой митохондриальной деполяризации (МД) в первичной культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы. Обнаружено, что в культуре гранулярных нейронов ингибиторы PLA2 задерживали наступление ОКД и МД. Измерения, выполненные на суспензиях митохондрий мозга и печени крысы в условиях, предотвращающих возникновение циклоспорин А-чувствительной неспецифической мегапоры (МРТ), показали, что перегрузка митохондрий суррогатом кальция — стронцием приводит к выбросу из них Sr2+, защелачиванию среды, снижению трансмембранного потенциала и набуханию митохондрий. Ингибиторы Са2+/$г -зависимой PLA2 подавляли перечисленные эффекты Sr2+ перегрузки. Результаты, полученные на изолированных митохондриях, свидетельствуют о возникновении неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий, отличающейся от МРТ и обусловленной активацией Са2+/$г2+-зависимой PLA2. Активация PLA2 ведет к образованию в митохондриях пальмитиновой и стеариновой кислот, которые обладают способностью связывать Са2+ с высоким сродством и формировать в митохондриях и искусственных фосфолипид-ных мембранах короткоживущую липидную пору. Исходя из данных, полученных на выделенных митохондриях и первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крысы, мы полагаем, что начальные стадии глутамат-индуцированной Са2+ дисрегуляции могут быть связаны с открытием в митохондриях нейронов пальмитат/Са2+ активируемой поры.
Ключевые слова: митохондрии, культура нейронов мозжечка, гиперстимуляция глутаматных рецепторов, пальмитат/Са2+-индуцируемая пора, ингибиторы фосфолипазы А2.
Многочисленными исследованиями установлено, что продолжительная стимуляция NMDA рецепторов мозга возбуждающим медиатором глутаматом (Glu) приводит к драматическим нарушениям Са2+ гомеостаза (так называемой отсроченной Са2+ дисрегуляции, ОКД) и глубокой митохондриальной деполяризации (МД), завершающимися гибелью нейронов [1—2].
До недавнего времени большинство исследователей полагало, что основной причиной возникновения ОКД является открытие во внутренней мембране митохондрий циклоспорин А
(ЦсА)-чувствительной поры, MPT (mitochondrial permeability transition pore). Однако в ряде исследований были обнаружены факты, поставившие под серьезные сомнения эту гипотезу [2]. Так, первоначально исследователи полагали, что ОКД и МД являются необратимыми процессами [3]. Затем было показано, что в начале своего развития ОКД и МД могут быть подавлены блокатора-ми NMDA-каналов или просто удалением Ca2+ из наружного раствора [2]. Кроме того, нами было показано, что во время ОКД и МД происходят изменения рН матрикса митохондрий и цитозоля (рНм и рНц), которые, в совокупности с измене-
483
4*
ниями концентрации Ca2+ в митохондриях ([Ca2+]j) и митохондриального потенциала (А¥), отражают повышение ионной проводимости внутренней мембраны митохондрий [4, 5].
Начальный этап повышения этой проводимости не связан с открыванием "классической" ЦсА-чувствительной поры, поскольку замена Ca2+ на Sr2+, который в отличие от Са2+ не способен открывать MPT [7], не препятствует возникновению отсроченной "стронциевой дисрегуля-ции" [4, 6]. Более того, в присутствии Sr2+ и ЦсА наблюдалось кратковременное увеличение градиента рН между матриксом и цитозолем, совпадающее с началом ОКД [4, 5], чего не должно быть, если бы развитие ОКД было полностью обусловлено MPT. Все эти факты побудили нас к поиску альтернативных механизмов Са2+-зависи-мой МД.
Мы полагаем, что в возникновении Glu-инду-цированной МД, по крайней мере на начальном этапе, принимает участие ЦсА-нечувствительная пальмитат/Са2+- индуцируемая липидная пора, которая открыта недавно [8, 9] и изучается в нашей лаборатории на протяжении последних 10 лет [8, 10—13]. Установлено, что эта пора образуется только теми жирными кислотами, которые связывают Са2+, а именно — пальмитиновой и стеариновой жирными кислотами [8].
Пальмитат/Са2+-индуцируемая пора по многим своим свойствам сильно отличается от "классической ЦсА-чувствительной MPT", но в качестве ее опознавательного признака лучше всего может быть использована ее способность открываться в ответ на избыточный вход в митохондрии не только ионов Са2+, но также и ионов Sr2+. Кроме того, липидную пору отличает способность спонтанно и быстро закрываться: открывание этой поры не происходит, как только вход Ca2+ в митохондрии прекращается [9—10]. Было также показано, что в изолированных митохондриях мозга крысы наблюдаются ЦсА-независимые флуктуации митохондриального потенциала [14], а реконструкция в БЛМ Са2+-связывающего компонента митохондрильной мембраны, содержащего пальмитиновую и стеариновую кислоты, сопровождалась флуктуациями Са2+ тока через мембрану [8, 15]. Следует подчеркнуть, что в нейронах, выделенных из различных отделов мозга, ОКД и МД также обратимы при удалении Са2+ из буфера [2].
Изучение механизма образования и регуляции пальмитат/Ca2+-индуцированных пор в митохон-дриальной мембране показало, что кратковременное открывание этих пор не повреждает митохондрии [10]. При долговременной (в течение 10 мин) рециклизации Са2+ с участием этих пор ингиби-рование входа Са2+ рутениевым красным ведет к полному восстановлению мембранного потенци-
ала в результате прекращения поступления Са2+ в митохондрии и последующего образования новых пор [11]. Механизм образования пальми-тат/Са2+-индуцируемой липидной поры может быть объяснен фазовой сегрегацией комплексов Са2+ с жирной кислотой в твердые мембранные домены, что приводит к фазовому переходу в ли-пидном бислое мембраны и формированию самопроизвольно затягивающихся липидных пор [12]. Целью настоящей работы является получение доказательств участия ЦсА-нечувствительной ми-тохондриальной липидной поры, индуцированной Са2+ и насыщенными жирными кислотами (преимущественно пальмитиновой), в механизме О1и-индуцированной МД и ОКД у культивируемых нейронов мозжечка крысы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение митохондрий печени крысы. Митохондрии выделяли из печени половозрелых белых крыс весом 220—250 г. Среда выделения для митохондрий печени содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 1 мМ ЕЭТЛ, 10 мМ НЕРЕ8-ШН (рН 7.4). Охлажденную в среде выделения печень отмывали от крови, продавливали через пресс с диаметром отверстий ~1 мм, а затем гомогенизировали тефлоновым пестиком в стеклянном гомогенизаторе Поттера (соотношение массы ткани и среды выделения 1 : 8). Гомогенат центрифугировали при 500 % и 800 % (4 и 6 мин соответственно). Митохондрии осаждали 20 мин при 6000 Осадок митохондрий суспендировали в среде, содержавшей 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 0.05 мМ ЕОТЛ, 10 мМ НЕРЕ8-КОН (рН 7.4), и вновь центрифугировали в течение 20 мин при 6000 Полученный митохондриальный осадок ресуспен-дировали в среде выделения, не содержавшей ЕЭТЛ и ЕОТЛ, из расчета 0.1 мл среды на 1 г печени. Полученная суспензия митохондрий содержала 90—100 мг митохондриального белка на 1 мл.
Выделение митохондрий мозга крысы. После декапитации мозг быстро извлекали и помещали в ледяную среду выделения, содержащую 250 мМ сахарозу, 0.5 мМ ЕОТЛ, 0.2 мг/мл БСА, 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.4). Изолированный мозг промывали 2—3 раза ледяной средой выделения, отделяли кору от остальных отделов мозга и измельчали. Измельченную ткань помещали в стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком, добавляли ледяную среду выделения (9 объемных частей) и гомогенизировали от мотора 2—3 проходами пестика. К полученному гомогенату добавляли равный объем среды выделения и центрифугировали при 4°С при ускорении 2000 % 5 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и оставляли на льду. Осадок ресуспендировали в среде выделения и вновь центрифугировали при 4°С при 2000 % 5 мин. Полученные супернатанты объединяли и
центрифугировали при 12000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в среде промывания, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4) и вновь центрифугировали при 4°C при ускорении 12000 g 10 мин. Полученный осадок митохондрий ресупендировали в среде промывания из расчета 0.1 мл на 1 г ткани. Полученная суспензия митохондрий содержала 30—40 мг митохондриального белка на 1 мл. Концентрацию митохондриально-го белка определяли методом Лоури.
Оценка функциональных параметров митохондрий. Мембранный потенциал митохондрий в суспензии оценивали по перераспределению катионов тетрафенилфосфония (ТФФ+) с помощью ТФФ+-чувствительного электрода. В этом случае среда инкубации была дополнена 1 мкМ ТФФ+. Концентрацию ионов Sr2+ в среде инкубации определяли с помощью Sr2+-селективного электрода. Изменение рН среды регистировали с помощью рН электрода InLab Micro (Metier Toledo, Швейцария). Изменения концентраций ТФФ+, Ca2+ и pH регистрировали одномоментно с помощью оригинальной многоканальной электрометрической системы Record 4 в кювете объемом 1 мл при п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.