БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 2, с. 169 - 177
УДК 577.24
МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННЫЕ АНТИОКСИДАНТЫ ПРЕДОТВРАЩАЮТ АПОПТОЗ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ВЫЗВАННЫЙ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ*
© 2014 И.И. Галкин13**, О.Ю. Плетюшкина14, Р.А. Зиновкин3,4, В.В. Захарова2,4, И.С. Бирюков2, Б.В. Черняк14, Е.Н. Попова14
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-0338, электронная почта: galkin.ivan.i@gmail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
биологический факультет, 119234 Москва
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ Митоинженерии, 119991 Москва
Поступила в редакцию 24.09.13 После доработки 23.10.13
Увеличение содержания провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли (ФНО) в крови вызывает дисфункцию эндотелия, приводит к развитию серьезных сосудистых патологий. В передачу сигналов от рецепторов ФНО вовлечены активные формы кислорода (АФК), одним из источников которых могут являться митохондрии. Для исследования роли митохондриальных АФК в развитии ФНО-зависимого апоптоза человеческих эндотелиальных клеток линии EAhy926 были использованы адресованные в митохондрии ан-тиоксиданты семейства SkQ. Было показано, что в субнаномолярных концентрациях они предотвращают апоптоз, индуцированный ФНО. При этом SkQ не влияют на ФНО-зависимую протеолитическую активацию каспазы-8 и белка Bid, но ингибируют Bid-зависимый выход цитохрома с в цитоплазму, а также последующее расщепление каспазы-3 и ее субстрата белка PARP. Кроме этого, SkQ вызывают возрастание содержания анти-апоптотического белка Bcl-2 и снижение содержания про-апоптотических белков Bax и p53. Фрагменты SkQ, лишенные антиоксидантной активности, не изменяли содержания анти- и про-апоптоти-ческих белков, не предотвращали выход цитохрома с в цитоплазму и апоптоз, индуцированные ФНО. Таким образом, показано, что ФНО-зависимый апоптоз эндотелиальных клеток в значительной мере зависит от продукции АФК в митохондриях, что указывает на перспективность изучения адресованных в митохондрии антиоксидантов семейства SkQ в качестве возможных вазопротекторов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эндотелий, апоптоз, митохондриально-направленный антиоксидант, воспаление, фактор некроза опухоли (ФНО).
Эндотелий сосудов выполняет ряд функций: он контролирует систему свертывания крови, тонус сосудов, кровоснабжение тканей, обмен жидкости и макромолекул между кровью и тканями, а также развитие иммунной системы и иммунный ответ [1]. Повреждение или чрезмер-
ная активация эндотелиальных клеток являются основной причиной сосудистых патологий [2]. В моделях in vitro многократно было показано, что многие стимулы, относящиеся к факторам риска сердечно-сосудистых заболеваний (в том числе, ФНО), вызывают апоптоз эндотелиаль-
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода; ФНО — фактор некроза опухоли; CM-DCF-DA — 5-(—6)-хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат; NAC — N-ацетилцистеин; PARP — поли(АДР-рибоза)-по-лимераза, SkQ — конъюгаты пластохинона и проникающих катионов; SkQ1 — пластохинолил-10(6'-децилтрифенил)фос-фоний; C12TPP — додецилтрифенилфосфоний; SkQRl — 10-(6'-пластохинолил)децилродамин-19; C12R1 — додецилрода-мин-19; TMRM — метиловый эфир тетраметилродамина; zVAD — ^бензоилоксикарбонил-Уа1-А1а-Ар-трифторметил-кетон.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-276, 05.01.2014.
** Адресат для корреспонденции.
ных клеток [3]. Более того, апоптоз эндотели-альных клеток был обнаружен in vivo при определенных патологиях у людей и животных, а также у стареющих животных [3, 4]. Существенным фактором риска возникновения эндотели-альных дисфункций является повышение содержания провоспалительных цитокинов, в частности, ФНО [5].
ФНО, связываясь с рецепторами на поверхности клеток, инициирует целый ряд сложных сигнальных каскадов [6, 7], которые могут приводить к различным последствиям, в зависимости от типа клеток и их состояния. В эндоте-лиальных клетках ФНО активирует секрецию факторов свертывания крови, работу NO-син-таз, экспрессию тканевых факторов, молекул адгезии, воспалительных цитокинов и хемоки-нов, трансэндотелиальный везикулярный транспорт, перестройку цитоскелета и разборку межклеточных контактов, а также запрограммированную клеточную гибель [5]. ФНО может инициировать апоптоз в клетках эндотелия как за счет прямой активации каскада каспаз [8], так и за счет высвобождения проапоптозных белков (цитохром с, AIF, DIABLO и др.) из митохондрий [9].
Важным фактором, модулирующим передачу сигналов от рецепторов ФНО, служат активные формы кислорода (АФК). Показано, что ФНО индуцирует генерацию клетками АФК, что способствует усилению сигналов, инициированных этим цитокином [10]. Источниками образования АФК под действием ФНО могут служить как митохондрии, так и NADPH-окси-дазы семейства NOX. На важную роль митохонд-риальных АФК указывают эксперименты, где оверэкспрессия митохондриальной супероксид-дисмутазы МпСОД (SOD2) приводила к подавлению ФНО-зависимой активации NF&B и МАРК [11], а также апоптоза [12]. В представленной ниже работе был использован другой подход, основанный на применении митохонд-риально-направленных антиоксидантов семейства SkQ [13]. Эти вещества относятся к группе проникающих катионов. Они чрезвычайно эффективно и селективно накапливаются в митохондриях благодаря высокой разности электрических потенциалов на внутренней мембране. SkQ предотвращают накопление АФК и гибель клеток при окислительном стрессе, а также модулируют различные сигнальные пути, действуя при этом в наномолярных концентрациях [14-17].
Ниже мы показываем, что митохондриаль-но-адресованные антиоксиданты предотвращают вызванный ФНО апоптоз. Это позволяет предположить, что наблюдаемое защитное
действие 8крЯ1 и его аналогов лежит в основе терапевтического эффекта этих соединений в моделях патологий почек и мозга [18, 19].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клеточная культура. Клетки эндотелия человека линии EaHy926 культивировали на среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, «Gibco», США), содержащей 10%-ную эмбриональную сыворотку («Hyclone», США), с добавлением гипоксантина и тимидина (HT) («Пан-эко», Россия) при 37° в атмосфере 5%-ной CO2 в условиях 100% влажности [20]. Для опытов клетки (100 тыс. клеток в мл.) выращивали в культу-ральных планшетах, для микроскопии в лунки помещали покровные стекла. После прикрепления и распластывания к клеткам добавляли ан-тиоксиданты или контрольные вещества и инкубировали 4 дня. Затем заменяли среду на DMEM, содержащую 0,2%-ную сыворотку. Через сутки добавляли рекомбинантный человеческий ФНО (любезно предоставлен Л.Н. Шин-гаровой, ИБХ РАН, Москва) в концентрациях 1—10 нг/мл на 3—18 ч (см. подписи к рисункам). В части опытов за 15 мин до ФНО к клеткам добавляли 1 мкм ZVAD («Sigma»). SkQ1, SkQR1, C12TPP и C12R1 были синтезированы Г.А. Коршуновой и Н.В. Сумбатян в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского как описано [21, 22].
Вестерн-блот. Все клетки собирали, промывали холодным PBS и лизировали однократным SDS-буфером (62,5 мМ Tris-HCl pH 6,8, 2%-ный SDS, 10%-ный глицерол, 50 мМ DTT, 0,01%-ный бромфеноловый синий). Лизаты инкубировали 3 мин при 95°. Белки разделяли ПААГ-электро-форезом и переносили на PVDF-мембрану («Amersham», США) и проводили иммунологические реакции в соответствии с протоколом фирмы-производителя антител. В качестве первых антител использовали: антитела против ци-тохрома с, Bax, p53, Bcl-2, PARP, а также активированных форм каспазы-3, каспазы-8 и bid («Cell Signaling», США). В качестве вторых антител использовали меченые пероксидазой хрена антитела против иммуноглобулинов кролика («Sigma-Aldrich», США). Для визуализации пе-роксидазной реакции использовали методику усиленной хемилюминесценции (ECL) («Amer-sham») в соответствии с протоколом производителя. Для получения изображений использовали медицинскую рентгеновскую пленку («Fotochemische Werke GMBH», ФРГ). Полученные изображения сканировали с разрешением 300 dpi и проводили денситометрический анализ в программе ImageJ 1.44p.
MИTOХOHДPИAЛЬHO-HAПPAВЛЕHHЫЕ AHTИOKСИДAHTЫ
171
Выделение цитоплазматической фракции для определения содержания цитохрома с. Цитоплаз-матическую фракцию собирали как описано ранее [23]. Клетки и клеточную среду собирали, двукратно промывали холодным PBS, ресуспен-дировали в буфере для гомогенизации (8,6%-ная сахароза, 10 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 2 мМ EDTA, 1 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, pH 7,4) и инкубировали 25 мин на льду, периодически встряхивая. Далее клетки гомогенизировали с помощью гомогенизатора со стеклянным пестиком, центрифугировали (1000 g, 10 мин), собирали супернатант и центрифугировали его (16 000 g, 15 мин). Супернатант отбирали и хранили при —80°.
Цитотоксический тест. Через два дня после добавления ФHO в лунки добавляли 0,5%-ный раствор МХГ («Sigma») в фосфатном буфере. Через 3 ч удаляли культуральную среду и растворяли кристаллы МХГ-формазана в DMSO («Sigma»). Oптическую плотность раствора измеряли, используя планшетный колориметр Thermo Labsystems Multiscan EX при длине волны 541 нм.
Определение уровня АФК. Для измерения содержания AФK клетки инкубировали с 5 ^M CM-DCF-DA («Molecular Probes») в течение 15 мин при 37°. Затем образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FC500 system, как было описано ранее [14].
Оценка количества клеток, погибших апоптозом. Через 2 дня после добавления ФHO все клетки собирали в центрифужные пробирки, промывали холодным фосфатным буфером и фиксировали ледяным раствором фосфатный буфер : : этанол 1 : 2. Инкубировали при +4° в течение суток. После этого клетки промывали фосфатным буфером и инкубировали в растворе фосфатного буфера, содержащего 30 мкг/мл йодистого пропидия («MP Biomedicals», Франция) и 10 нг/мл PHKазы A («Fermentas») в темноте в течение 45 мин при 37°, затем обр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.