БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 10, с. 1355 - 1366
УДК 617.7-001.15
ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ И ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЙСТВИЕ SkQ1-СОДЕРЖАЩИХ ГЛАЗНЫХ КАПЕЛЬ ВИЗОМИТИН ПРИ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА
© 2014 Ю.П. Новикова1, О.С. Ганчарова2*, О.В. Эйхлер2, П.П. Филиппов2, Э.Н. Григорян1*
1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, 119334 Москва; факс: (499)135-8012, электронная почта: leonore@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: (495)939-0978, электронная почта: fxb@genebee.msu.su, olgancharova@gmail.com
Поступила в редакцию 16.05.14
Сетчатка глаза человека постоянно подвергается повреждению из-за воздействия света различной интенсивности, особенно при этом страдают ее фоторецепторные клетки и пигментный эпителий. Для индуцирования повреждения сетчатки под действием света традиционно применяют модель LIRD (light-induced retinal degeneration) на крысах-альбиносах, глаза которых освещают видимым светом высокой интенсивности. Эта модель позволяет изучать протекающие в сетчатке патологические процессы и проводить поиск ретинопротекторов, защищающих ее структуры от светоповреждения. Кроме того этиология и механизмы повреждения сетчатки в условиях модели LIRD имеют много общего с механизмами развития зависимых от возраста заболеваний сетчатки, в частности связанной со старением макулодистрофии сетчатки (age-related macular degeneration, AMD). На модели LIRD изучено профилактическое и лечебное действие глазных капель визомитин, содержащих митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1, на поврежденную ярким светом сетчатку крыс-альбиносов. В первой серии экспериментов крысы, получавшие визомитин в течение двух недель до облучения, демонстрировали значительно менее выраженные атрофические и дегенеративные изменения сетчатки, чем животные, получавшие такие же капли, но без SkQ1. Во второй серии экспериментов облученным крысам в течение двух недель закапывали визомитин или такие же капли, но без SkQ1. При этом оказалось, что поврежденная сетчатка под действием SkQ1 восстанавливается эффективнее, чем у контрольных животных. Сделан вывод, что SkQ1-содержащие капли визомитин оказывают как профилактическое, так и лечебное действие на сетчатку в условиях облучения ярким светом и могут быть рекомендованы как фотопротекторное средство и, вероятно, как средство, улучшающее состояние сетчатки при старческой макулодистрофии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сетчатка, фоторецепторы, фотоповреждение, модель LIRD, ретинопротектор, визо-митин, SkQ1.
Активные формы кислорода (АФК), основным источником генерации которых служит митохондриальный электронный транспорт [1—3], способны вызывать значительные повреждения клеток различных типов. Это особенно справедливо для сетчатки глаза, которая
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода; ВЯС — внутренний ядерный слой сетчатки; НЯС — наружный ядерный слой сетчатки; ФС — фоторе-цепторный слой; НПС — наружный плексиформный слой; ВПС — внутренний ядерный слой; ГС — ганглиозный слой (слой ганглиозных клеток); ПЭС — пигментный эпителий сетчатки; LIRD — light-induced retinal degeneration. * Адресат для корреспонденции.
на протяжении жизни подвергается воздействию потока фотонов, а для ее клеток характерны высокая скорость метаболизма кислорода и большое содержание полиненасыщенных жирных кислот [4, 5]. Тем самым создаются условия для регулярной продукции в сетчатке большого количества АФК, которые повреждают ее структуры, причем в первую очередь это касается фоторецепторных клеток, представленных палочками и колбочками [6—11]. На большом количестве in vitro и in vivo моделей продемонстрировано, что проникающий катион 10-(6'-пластохиноил)децилтрифенилфос-фоний, названный SkQ1, обладает высокой ан-тиоксидантной активностью благодаря его
способности удалять АФК из митохондриаль-ного матрикса [12—14].
По нашим более ранним данным [15, 16], ан-тиоксидант SkQ1 оказывает защитное действие на нейральную сетчатку, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и хороид, культивируемые в составе препаратов заднего сегмента глаза крыс-альбиносов, значительно снижая клеточную гибель в этих структурах и предотвращая макро-фагальную трансформацию клеток ПЭС. В настоящей работе мы исследовали способность SkQ1-содержащих глазных капель визомитин оказывать профилактическое и лечебное действие на сетчатку крыс-альбиносов, у которых повреждение сетчатки вызывали путем их облучения светом высокой интенсивности в соответствии с моделью LIRD (light-induced retinal degeneration) [17, 18].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глазные капли визомитин были получены из НИИ митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова. Состав капель (в расчете на 100 мл): 0,0155 мг SkQ1, 10 мг хлористого бензалкония, 200 мг окси-пропилметилцеллюлозы, 900 мг хлорида натрия; 810 мг дигидрофосфата натрия, 1,1635 г додеко-гидрата гидрофосфата натрия, вода для инъекций до общего объема 100 мл.
Животные. В эксперименте использовали здоровых двухмесячных самок крыс-альбиносов линии Wistar (n = 36), шесть из которых служили интактным контролем. Перед началом эксперимента животных содержали в обычных условиях вивария (12 ч свет/12 ч темнота), регулярно проводя внешний осмотр их глаз; по завершении эксперимента крыс декапитировали под хлоралгидратным («Sigma», США) наркозом (500 мг/кг внутрибрюшинно). Все процедуры соответствовали протоколам, утвержденным комиссией по биоэтике РАН, и были выполнены с соблюдением этических правил Европейской директивы FELASA-2010.
Повреждение сетчатки глаза крыс-альбиносов с использованием модели LIRD. Перед освещением крыс выдерживали в темноте 14 ч для темно-вой адаптации их глаз, затем облучали в течение 14 ч. Источником видимого света высокой интенсивности служила металлогалогеновая лампа NC-DE 70W/DW RX7s («NARVA», Германия) со следующими техническими характеристиками: мощность 70W, световой поток 5000—5500 люмен, цветовая температура 4000 К. Лампу располагали на расстоянии 2 м от клеток с животными, что давало интенсивность освещения сетчатки, равную 2500—3000 люкс.
Профилактическое действие SkQ1-содержащих глазных капель визомитин на сетчатку крыс-альбиносов. Крысы (n = 18) опытной (n = 9) и контрольной (n = 9) групп в течение 15 дней получали соответственно SkQl-содержащие глазные капли или такие же капли, но без SkQl (плацебо); в обоих случаях вводили по одной капле в день в левый и правый глаз каждого животного. По завершении курса следовало облучение светом высокой интенсивности, затем животных в течение 3 ч содержали в темноте. Сразу после этого по 6 крыс из опытной и контрольной групп забивали. Оставшихся животных (по 3 из каждой группы) в течение 15 дней содержали в обычных условиях (без облучения и применения капель), после чего забивали.
Лечебное действие SkQ1-содержащих глазных капель визомитин на сетчатку крыс-альбиносов. Крыс (n = 12) облучали светом высокой интенсивности, после чего их в течение 15 дней содержали в обычных световых условиях. Опытная группа (n = 6) облученных животных получала SkQ1-содержащие глазные капли, а контрольная группа (n = 6) — капли такого же состава, но без SkQ1 (плацебо); в обоих случаях животные получали по одной капле в день в левый и правый глаз. По завершении 15-дневного курса применения капель животных забивали.
Гистологическая обработка. Глазные яблоки, выделенные сразу после декапитации животных, помещали в фиксирующий раствор Буэна, и через двое суток из них изолировали задний сегмент, содержащий сетчатку, хороид и склеральную оболочку. Затем фиксированные препараты заднего сегмента глаза отмывали в 70%-ном спирте и подвергали рутинной гистологической обработке, включающей обезвоживание в спиртах повышающейся концентрации и заливку правильно ориентированных образцов в парафин. Из парафиновых блоков на микротоме («Reichert», Австрия) получали сагиттальные серийные срезы (500 от каждого глаза) толщиной 7 мкм. Срезы, закрепленные на предметных стеклах («Menzel-G^er», Германия), депарафи-нировали, регидратировали и окрашивали по стандартному протоколу гематоксилином Ка-раччи и эозином, после чего заключали их в канадский бальзам.
Морфометрический анализ. Серийные гистологические препараты изучали с помощью микроскопов Vanox AH-3 («Olympus», Япония), Jenaval («Carl Zeiss», Германия) и AxioScope A.1 («Carl Zeiss», Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой камеры высокого разрешения AxioCam MRc5 («Carl Zeiss», Германия). Просмотр и обработку микрофотографий, добавление к ним шкал и морфометри-
ческие измерения выполняли, используя программное обеспечение AxioVision 8.0 («Carl Zeiss», Германия) и Adobe Photoshop CS6 Extended («Adobe Systems», США).
Ширину наружного ядерного слоя сетчатки (НЯС) исследовали через 3 ч после фотоповреждения. Для оценки изменения этого параметра под действием света от каждой группы, забитой через 3 ч после фотоповреждения, отбирали случайным образом по 2 препарата сетчатки. В 60 серийных срезах от каждого такого препарата делали по 500 измерений ширины НЯС в восьми разных его областях от дорсальной до вентральной сторон глаза (две дорсопериферичес-кие области, две дорсоцентральные области, две вентроцентральные области и две вентропери-ферические области).
Площадь атрофии НЯС оценивали через 15 сут после облучения, для чего от каждой группы крыс, забитых через 15 сут после освещения, отбирали по два препарата сетчатки с наиболее тяжелыми повреждениями. Площадь атрофии НЯС определяли как произведение числа последовательных срезов, в которых была найдена атрофия НЯС, толщины среза (7 мкм) и протяженности зоны атрофии (в мкм) в каждом из срезов.
Длину внутренних сегментов фоторецептор-ных клеток определяли в зоне наибольшей светочувствительности на 60-ти случайным образом отобранных срезах из каждой группы. Полученные данные обрабатывали статистически, определяя наличие статистически значимой разницы средних величин выборок с помощью критерия Манна—Уитни на уровне p = 0,05. Вычисления и построение графиков проводили с помощью программ MS Offi
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.