БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 645 - 660
УДК 577.1:581.1
МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ЭНЕРГОРАССЕИВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ (АЛЬТЕРНАТИВНАЯ ОКСИДАЗА, РАЗОБЩАЮЩИЕ БЕЛКИ И «ВНЕШНЯЯ» NADH-ДЕГИДРОГЕНАЗА) ВОВЛЕЧЕНЫ В РАЗВИТИЕ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ*
© 2014 О.И. Грабельных1**, О.А. Боровик1, Е.Л. Таусон1, Т.П. Побежимова1, А.И. Катышев1, Н.С. Павловская1, Н.А. Королева1, И.В. Любушкина1, В.Ю. Башмаков2, В.Н. Попов2, Г.Б. Боровский1, В.К. Войников1
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132; факс: (3952)510-754, электронная почта: grolga@sifibr.irk.ru
2 Воронежский государственный университет, 394006 Воронеж,
Университетская пл., 1; факс: (4732)208-755, электронная почта:popov@vsu.ru
Поступила в редакцию 09.08.13 После доработки 09.12.13
Изучена экспрессия генов, синтез белков и активность альтернативной оксидазы (АОХ), разобщающих белков (UCP), адениннуклеотид транслокатора (ANT) и несопряженных МАВ(Р)Н-дегидрогеназ (NDex, NDPex и NDin) в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы Triticum aestivum L. после действия закаливающих низкой положительной (2°, 7 сут) и отрицательной (—2°, 2 сут) температур. Установлено, что холодовое закаливание эффективно повышает морозоустойчивость проростков и снижает генерацию активных форм кислорода (АФК) при последующем холодовом шоке. Одним из механизмов снижения АФК в этих условиях может быть функционирование митохондриальных энергорассеивающих систем. Участие этих систем в ответной реакции на действие закаливающих низкой положительной и отрицательной температур отличается. Действие первой вызывает индукцию синтеза АОХ и UCP, сопряженную с повышением способности АОХ к транспорту электронов в дыхательной цепи митохондрий и повышением чувствительности нефосфорилирующего дыхания митохондрий к линолевой и пальмитиновой кислотам. Повышение способности АОХ к транспорту электронов после действия на проростки закаливающей отрицательной температуры связано с сохранением высокой активности NDex. По-видимому, NDex, но не NDPex и NDin, играет важную роль в поддержании функционального состояния митохондрий в гетеротрофных тканях растений при действии отрицательных температур. Обсуждается участие энергорассеивающих систем митохондрий в процессе адаптации озимых злаков к холоду и морозу и их возможная физиологическая роль.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Triticum aestivum L., холодовое закаливание, активные формы кислорода, экспрессия генов, энергорассеивающие системы митохондрий.
Окислительные реакции, происходящие в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий, приводят к образованию электрохимического градиента протонов (АцН+), который используется АТР-синтазой для фосфорилирова-
ния ADP в АТР. Однако не всегда процесс окисления сопряжен с фосфорилированием. В митохондриях функционируют т.н. энергорассеивающие системы, которые снижают энергетическую эффективность окислительного фосфори-
Принятые сокращения: АОХ — альтернативная оксидаза; АП — альтернативный путь; АФК — активные формы кислорода; ДТТ — дитиотреитол; ПЦР — полимеразная цепная реакция; UCP — разобщающий белок; СЖК — свободные жирные кислоты; ЦП — цитохромный путь; ANT — адениннуклеотид транслокатор; NDex (NDB2) — «внешняя» NADH: хинон-оксидоредуктаза; NDin (NDA2) — «внутренняя» несопряженная NADH:хинон-оксидоредуктаза; NDPex (NDB1) — «внешняя» NADPH:хинон-оксидоредуктаза.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 12-222, 23.02.2014.
** Адресат для корреспонденции.
лирования путем рассеивания в виде тепла части энергии, генерируемой ЭТЦ митохондрий как до, так и после преобразования ее в энергию трансмембранного градиента [1]. В числе таких энергорассеивающих систем у растений: альтернативная антимицин А- и цианид-устойчивая оксидаза (АОХ) [2—4], «внешние» и «внутренние» несопряженные МАО(Р)Н-дегидрогеназы (ND(P)ex и ND(P)in соответственно) [5], свободные жирные кислоты (СЖК) [6—7] и связанные с ними разобщающие белки, подобные UCP животных (uncoupling protein) [8—9] и аде-ниннуклеотид транслокатор (adenine nucleotide translocator, ANT) [6]. Возросший в последние годы интерес к изучению данных систем объясняется важностью выполняемых ими функций, среди которых термогенез, регуляция образования активных форм кислорода (АФК), активных форм азота и регуляция энергетического и метаболического баланса [3, 6, 10—12]. Более подробный анализ возможной роли систем свободного окисления в регуляции образования АФК дан в обзоре [13]. Снижение способности предотвращать образование АФК в митохондриях или их нейтрализовать является одной из причин программируемой клеточной гибели у растений [14].
Холодовое закаливание придает озимым культурам способность переносить воздействие неблагоприятных отрицательных температур [15—16], что является характерной чертой биологии данной группы растений. Большое количество работ свидетельствует о повышении уровня транскриптов, содержания белка и активности АОХ под действием низких положительных температур у различных растительных объектов [17—28]. В то же время существуют данные об отсутствии положительной корреляции между содержанием АОХ, ее активностью и холодоустойчивостью растений [17, 18]. У пшеницы идентифицировано два гена, кодирующих AOX — WAOX1a и WAOX1c, содержание транс-криптов которых возрастает при закаливании к холоду (4°) [19, 24]. Наряду с накоплением транс-криптов увеличивается способность АОХ к транспорту электронов, причем в большей степени у более морозоустойчивой озимой пшеницы, по сравнению с менее устойчивой яровой [24]. Трансгенез WAOX1a в клетки Arabidopsis thaliana подтвердил гипотезу об антиоксидант-ной функции АОХ при низкой температуре [21]. Антиоксидантная функция АОХ и увеличение вклада альтернативного пути (АП) в дыхание обнаружены в митохондриях этиолированных проростков озимой пшеницы при закаливании к холоду [28]. У пшеницы разобщающий белок UCP1 кодируется генами WhUCPM и WhUCP1b
и, хотя их индукцию под действием низкой температуры не наблюдали [29], в промоторной области AtUCP1, кодирующего UCP1 у арабидоп-сиса, идентифицированы АБК-связанный элемент (ABRE) и четыре G-box элемента [30]. Присутствие таких регуляторных элементов согласуется с индукцией синтеза UCP1 у арабидоп-сиса при низких температурах [10, 23]. Показано, что при холодовом воздействии вместе с индукцией генов, кодирующих АОХ и UCP, может происходить коэкспрессия гена, кодирующего NDex (NDB2) [27, 31]. Известно, что функциональное состояние комплексов ЭТЦ митохондрий оказывает влияние на индукцию COR-ге-нов (cold-regulated) и морозоустойчивость растений [32]. В то же время, в литературе отсутствуют данные по влиянию отрицательной температуры, характерной для второго этапа холо-дового закаливания озимых злаков, на экспрессию генов, кодирующих компоненты ATP-син-тазы и энергорассеивающих систем митохондрий, содержание белков и их активность. Относительно экспрессии генов и функционирования несопряженных NAD(P)H-дегидрогеназ в митохондриях озимых злаков при холодовом закаливании также ничего не известно.
В связи с этим, целью работы явился сравнительный анализ влияния закаливающих низкой положительной и отрицательной температур на экспрессию генов, синтез белков и активность альтернативной оксидазы, разобщающих белков и несопряженных NAD(P)H-дегидрогеназ у озимой пшеницы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный материал. Объектом исследования служили побеги проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Иркутская), выращенные в течение 3 сут на влажной фильтровальной бумаге в темноте при 25 ± 1° (контроль). Для прохождения первого этапа холодового закаливания проростки выдерживали 7 сут в темноте при температуре 2° (хол. зак. 1 этап), а затем в течение 2 сут при температуре —2° для прохождения второго этапа холодового закаливания (хол. зак. 2 этапа).
Определение морозоустойчивости проростков. Морозоустойчивость контрольных и холодоза-каленных проростков озимой пшеницы определяли по их отрастанию после промораживания при температурах —4, —6, —8, —10, —12, —14, -16° в камере BINDER MKT 240 (Германия) опытной станции Фитотрон СИФИБР СО РАН. Снижение температуры происходило раз в сутки со скоростью 1°/ч. После промораживания
проростки оттаивали в течение 2 сут при температуре 2°, а затем оставляли для отрастания при контрольной температуре. Учет выживших от общего числа проростков проводили через 7 сут после промораживания.
Определение содержания углеводов. Водорастворимые углеводы определяли с антроновым реактивом [33]. Содержание углеводов рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по сахарозе, в % от абсолютно сухого веса.
Выделение РНК и получение кДНК. Тотальную клеточную РНК выделяли с помощью набора «SV Total RNA Isolation System» («Promega», США). Концентрацию РНК определяли спект-рофотометрически при длине волны 260 нм, о степени чистоты полученных препаратов судили по соотношению А260/А280 (1,8—2,1).
Построение первой цепи осуществляли с помощью набора «РЕВЕРТА» («АмплиСенс», ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно рекомендациям фирмы производителя с некоторыми модификациями. Для проведения обратной транскрипции использовали 2 мкг тотальной клеточной РНК и 40 мкМ праймера олиго-(dT)18. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносили ингибитор РНКаз RNAsine («ThermoScientific», Литва) в концентрации 1 ед/мкл реакционной смеси.
Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ). ПЦР РВ проводили на приборе CFX96 («Bio-Rad», США), используя в качестве красителя SYBR Green I («Sigma», США) и набор реактивов фирмы «Fermentas» («ThermoScientific»). Общий объем ПЦР реакции составлял 25 мкл, включая 2 ед. Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл кДНК. В работе использовали ген-специфичные праймеры к генам COR14, NAD7, COB, COX2, ATP6, UCPla, UCPlb, AOXla, AOXlc, ANT1, NDA2, NDB2, Ta2291 и Ta2776.
Последовательности праймеров к генам NAD7, COB, COX2 и ATP6 взяты из работы Найденова с соавт. [34], к генам COR14, Ta2291 и Ta2776 из работы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.