МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 5, с. 682-690
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.873.11.082.56
МНОГОЛЕТНЕЕ ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИОННЫХ
КУЛЬТУР АКТИНОБАКТЕРИЙ © 2012 г. С. Н. Филиппова1, Н. А. Сургучева, В. Ф. Гальченко
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 24.03.2011 г.
Исследованы 553 коллекционные культуры актинобактерий, включая 453 эталонных штаммов ISP, после многолетнего хранения в: лиофильно-высушенном состоянии, в виде почвенных культур и под слоем вазелинового масла. Установлено, что уровень их жизнеспособности близок к критическому. Использование ряда методических подходов по оптимизации процессов реактивации и пролиферации клеток актинобактерий позволило восстановить жизнеспособность и основные культу-рально-морфологические свойства 65% лиофилизированных, а также хранившихся под слоем вазелинового масла актинобактерий. Актинобактерии, хранившиеся в виде почвенных культур, практически полностью утратили жизнеспособность. Реактивированные актинобактерии характеризовались высоким уровнем генетической нестабильности, что проявлялось в выщеплении более 3-х фенотипов с различными типами колоний. При этом популяционный спектр изменялся в сторону увеличения доли минорных фенотипов с пониженной способностью к спорообразованию. У целого ряда восстановленных после хранения штаммов отмечалось значительное изменение куль-турально-морфологических свойств. Показана целесообразность применения соединений с антиокислительной и ростстимулирующей активностью для восстановления жизнеспособности и стабилизации культур актинобактерий после длительной консервации.
Ключевые слова: актинобактерии, многолетнее хранение, восстановление жизнеспособности культур, стабилизация свойств.
Сохранение жизнеспособности и стабилизация основных свойств микроорганизмов в течение длительного срока хранения — основная задача коллекционных работ. Ее решение требует понимания основных механизмов выживания микроорганизмов. Возможность восстановления жизнеспособности актинобактерий после многолетнего хранения свидетельствует о высоком потенциале процессов репарации у этих организмов. Проведение работ по восстановлению коллекционных штаммов актинобактерий, в особенности тех, на которых основано первоначальное описание того или иного таксона, а также его ценных в практическом отношении свойств, важно при осуществлении таксономических и биотехнологических исследований.
В результате многолетних исследований в лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии РАН собрана и изучена обширная коллекция актинобактерий. Коллекционный фонд актино-бактерий включает представителей различных таксономических групп как мицелиальных, так и немицелиальных форм. Основу фонда составляет коллекция культур, созданная усилиями проф.
1 Автор для корреспонденции (е-шаП: svfilipova@mail.ru).
В.Д. Кузнецова, значительную часть которой занимает коллекция типовых штаммов (эталонов) видов стрептомицетов, описанных в результате проведения международного проекта (International Streptomyces Project — ISP) по переописанию типовых штаммов видов рода Streptomyces. Основной целью ISP было создание общедоступной коллекции таксономически охарактеризованных штаммов актиномицетов [1—4], рассматриваемых как видовые эталоны, которые должны использоваться при сравнительном изучении вновь выделяемых из природных источников культур при их идентификации. В настоящее время, в связи с перегруппировкой видов внутри рода Streptomyces, некоторые штаммы, описанные в рамках международного проекта по переописанию типовых штаммов, утратили статус типовых. Однако и на сегодняшний день эта коллекция не потеряла своего значения благодаря востребованности для проведения различного рода исследований по биологии стрептомицетов и близких им организмов.
В настоящей работе представлены результаты изучения долгосрочного хранения (40 лет) 453 коллекционных штаммов ISP и 100 коллекционных штаммов ИНМИ РАН актинобактерий (22 года хранения) в лиофилизированном состоя-
нии, под слоем вазелинового масла и в виде почвенных культур.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования явились 453 коллекционных штамма ISP, относящихся к родам Strep-tomyces (449), Saccharopolyspora (1), Amycolatopsis (2), Nocardiopsis (1), заложенные на длительное хранение в 1969 г. в лиофильно-высушенном состоянии, под вазелиновое масло и в виде почвенных культур [5]. Кроме того, в работу по восстановлению жизнеспособности и культурально-морфологических свойств были включены 100 штаммов актинобактерий из коллекции лаборатории, принадлежащих к 15 различным родам и хранившихся в лиофилизированном виде, под вазелиновым маслом и в виде почвенных культур с 1988 г. В качестве защитной среды при лиофили-зации использовали нормальную лошадиную сыворотку без консерванта, последующее хранение проводили при температуре 4°С. Хранение в виде почвенных культур и под вазелиновым маслом осуществляли при комнатной температуре.
Реактивацию длительно хранящихся лиофи-лизированных культур актинобактерий проводили: непосредственным высевом на питательные среды сухого материала или с предварительной ре-гидратацией лиофилизированных клеток при: а) выдерживании во влажной камере в течение 24 ч, б) суспендировании в стерильной водопроводной воде, в) суспендировании в регидратирующей среде. В качестве регидратирующей среды использовали водный раствор, содержащий пептон — 0.5%, дрожжевой экстракт — 0.3%, MgSO4 • 7H2O — 0.1% (National Biological Resource Center, NBRC, Япония). Для регидратации лиофилизированных клеток ряда культур (1982 года закладки на хранение) использовали также водные растворы растительного сока Callisiafragrans в разведении 1 : 100 [6].
В экспериментах по восстановлению жизнеспособности лиофилизированных культур акти-нобактерий (1968 года закладки на хранение) были использованы также природные фенольные соединения с антиоксидантной активностью: кверцетин (3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone dehydrate), а-токоферол, дофамин (3-hydroxytyramine hydrochloride) ("Fluka") и адреналин ((—^epinephrine; (R)-(—)-3,4-dihydroxy-a-(methylami-nomethyl)benzyl-3,4-alcohol) ("Fluka"). Изучение действия соединений с антиоксидантной активностью проводили по следующей методике. Объединенные водные суспензии лиофилизирован-ного материала из 5 ампул каждого штамма делили на 5 равных частей, одна из которых служила в качестве контроля, а в остальные добавляли анти-оксиданты до конечной концентрации 10-5 М.
Для проведения сравнительных экспериментов использовали ампулы с лиофилизированны-ми клетками каждого штамма одного года закладки на длительное хранение. Выживаемость культур определяли путем высева суспензий в двух повторностях на среде ISP-3 с 0.25% дрожжевого экстракта ("Difco") и подсчета числа колониеоб-разующих единиц (КОЕ).
Для определения жизнеспособности и культу-рально-морфологических признаков длительно хранящихся актинобактерий использовали стандартные питательные среды, разработанные в результате международного опыта ISP [7]: ISP-1, ISP-2, ISP-3, lSP-6, ISP-7, а также синтетическую среду СР1 с глюкозой (жидкую и агаризованную) и голодный агар [8]. Культуры обозначены под регистрационными номерами коллекции лаборатории, а также с использованием акронима "RIA".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенные исследования показали, что уровень жизнеспособности коллекционных культур после долгосрочного хранения близок к критическому. Отмечен высокий процент (35%) утративших жизнеспособность штаммов актинобакте-рий, хранившихся всеми указанными способами.
При хранении в виде почвенных культур при комнатной температуре исследуемые актинобак-терии практически утратили жизнеспособность. Из литературы известно, что способ хранения в виде почвенных культур мало пригоден для многолетнего хранения значительной части стрептоми-цетов и близких им организмов, но является достаточно эффективным для стабилизации их основных культурально-морфологических свойств [9, 10]. В результате проведенных ранее исследований по изучению жизнеспособности эталонных культур ISP было установлено, что после 9 лет хранения в почве утратили жизнеспособность 51% культур, а после 12 лет — 88.5% [10]. После долгосрочного хранения под слоем вазелинового масла удалось восстановить жизнеспособность 63% исследованных штаммов. При этом наблюдался рост, главным образом, в виде единичных колоний, лишенных воздушного мицелия и пигментации. Для восстановления способности к формированию воздушного мицелия и пигментообразованию проводили пассирование через агаризованные питательные среды, а также 1-2-кратное пассирование через почву, обогащенную комплексом витаминов группы В и глюкозой [11].
При высеве лиофилизированного материала у значительной части исследованных штаммов ак-тинобактерий наблюдали изреженный рост в виде отдельных колоний, что, очевидно, связано с отмиранием большей части клеток в процессе хранения.
Ранее отмечалось, что процесс лиофилизации и последующее хранение в лиофильно-высушен-ном состоянии может индуцировать возрастание фенотипической изменчивости актиномицетов [5]. При этом состав популяции изменялся в сторону увеличения количества фенотипов с пониженной способностью к спорообразованию (или утративших ее полностью), т.е. минорных вариантов ("олигоспоровых", "белых", "аспороген-ных" [12]), с низким уровнем биосинтетической активности или лишенных таковой [13]. В настоящей работе у 83% исследованных актинобактерий отмечено повышение внутрипопуляционной изменчивости за счет возрастания количества минорных фенотипов. Изменение культурально-морфологических свойств исследованных штаммов после долгосрочного хранения может также сопровождаться изменениями физиолого-биохи-мических свойств клеток под влиянием неблагоприятных факторов хранения. Установлено, что после длительного хранения в лиофилизирован-ном состоянии у 25% всех исследованных культур отмечалось ослабление или полная утрата способности к образованию воздушного мицелия и спор; 36% исследованных культур характеризовались сниже
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.