научная статья по теме МНОГОСТУПЕНЧАТАЯ ИНТРОДУКЦИЯ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ ПРИ РАЗНОЙ ИСХОДНОЙ ИНОКУЛЯЦИОННОЙ ЧИСЛЕННОСТИ Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «МНОГОСТУПЕНЧАТАЯ ИНТРОДУКЦИЯ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ ПРИ РАЗНОЙ ИСХОДНОЙ ИНОКУЛЯЦИОННОЙ ЧИСЛЕННОСТИ»

ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2009, № 9, с. 1117-1123

БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ ПОЧВ

УДК 579.64:631.46

МНОГОСТУПЕНЧАТАЯ ИНТРОДУКЦИЯ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ ПРИ РАЗНОЙ ИСХОДНОЙ ИНОКУЛЯЦИОННОЙ

ЧИСЛЕННОСТИ*

© 2009 г. Ä. Ä. Куприянов1, Ä. М. Семенов1, Н. Н. Куненкова1, Ä. X. К. Ван Бругген2

биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы

e-mail: aakupriyanov@mail.ru 2Группа органического земледелия Университета Вагенингена, 6709 PG Вагенинген, Нидерланды

e-mail: ariena.vanbruggen@wur.nl Поступила в редакцию 01.12.2008 г.

Исследована популяционная динамика сапротрофной - Pseudomonasfluorescens 32 gfp и двух условно патогенных энтеробактерий: E. coli O157:H7 и Salmonella enterica var. Typhimurium при их интродукции с разной исходной инокуляционной дозой в экскременты крупного рогатого скота и последующем перемещении в почву, на растения и через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) беспозвоночных. Показано, что все исследованные интродуценты способны преодолевать экологические барьеры при перемещении через вышеназванные природные субстраты-местообитания. Интродуценты сохраняют высокую популяционную плотность даже при самой низкой начальной инокуляционной дозе - 105 КОЕ/г сухого вещества. Выявлено, что растения являются благоприятным субстратом для выживания исследуемых бактерий, в частности, для энтеропатогенов. Также установлено, что энтеропатогены способны проходить через ЖКТ беспозвоночных, которые тем самым могут являться инкубаторами и переносчиками энтероинфекций в природе.

ВВЕДЕНИЕ

Прослеживание судьбы популяций микроорганизмов в естественных субстратах, а тем более их активности, всегда являлось важной областью для почвенных микробиологов [4, 5, 8, 20, 22]. Исследованию популяционной динамики микроорганизмов, способных фиксировать азот, разрушать ксенобиотики, уничтожать другие поллю-танты или наоборот стимулировать рост растений и супрессировать их патогенов посвящены тысячи публикаций [1, 13, 16, 19, 23].

В настоящее время в развитых странах широко развернулось движение за производство экологически чистых продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов. Внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почвы - не редкость в повседневной практике. Это несет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий, как E. coli O157: H7, Salmonella spp., Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и некоторыми другими. Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогенов традиционно считали животных. Однако последние

* Исследования поддержаны NWO - Russia collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C. van Bruggen и A.M. Semenov and NWO fellowship for A.M. Semenov (Dossier number 040.11.057).

исследования показывают, что они успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных [24]. Именно этим вызваны массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных исследовательских центрах [15, 17, 21].

На примере сапротрофных микроорганизмов, интродуцируемых в почву, установлены некоторые общие закономерности поведения интроду-центов. Обычно после внесения интродуцента при наличии питательных веществ в субстрате численность интродуцента может несколько увеличиться [8]. Со временем, из-за истощения питательных веществ, конкуренции и хищничества, численность интродуцента, как правило, уменьшается. При этом в течение некоторого времени скорости размножения и отмирания интродуцента могут уравновешиваться с наступлением ква-цистационарного состояния [6]. Дальнейшая судьба интродуцента опять зависит от трофических, физико-химических и биотических факторов [3, 12].

В большинстве работ исследователи наблюдают за поведением интродуцента только в одном субстрате, в который была введена популяция микроорганизма. Такой подход во многих случаях оправдан. Более того, нередко ставилась специальная задача, а именно, чтобы интродуцент, после выполнения своей функции в среде, подвергся полной элиминации. К сожалению, это происходит далеко не всегда, о чем свидетельствует цир-

кулирование в природе как полезных, так и вредных и даже очень опасных для человека, животных и растений микроорганизмов. Таким образом, результаты, в которых исследователь ограничивается слежением за интродуцентом только первой ступенью интродукции, не могут удовлетворять современным требованиям ни с точки зрения чисто фундаментальных познаний экологии микроорганизмов, ни, тем более, с точки зрения практических аспектов распространения микроорганизмов в различных эконишах. Вопросы перемещения популяций микроорганизмов через ряд взаимосвязанных природных субстратов, что можно назвать "многоступенчатой" интродукцией, становятся как никогда актуальны. Вероятность, даже обыденность таких событий более чем очевидна, однако пока существует довольно мало работ, экспериментально исследующих многоступенчатую интродукцию, чтобы можно было бы говорить о каких-то общих закономерностях, а тем более использовать их на практике [9, 18].

Целью исследований было определение характера динамики выживания бактерий, интродуци-рованных в разной исходной численности в экскременты крупного рогатого скота и при последующих перемещениях их в почву, на растения и через ЖКТ беспозвоночных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроорганизмы и среды для их выращивания и выявления. Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP): Salmonella enterica var. Typhimurium MAE 110 gfp (в дальнейшем для краткости будем использовать только S. Typhimurium) получена от д-ра Юты Ремлинг (микробиологический центр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция), Escherichia coli O157:H7 gfp получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, университет Вагенингена, Нидерланды, Pseudomonas fluorescens 32 gfp получена от д-ра Роналда Дж. Сэйлера (биологический факультет, университет Арканзаса, США). Исследования проводились с ан-тибиотикоустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).

S. Typhimurium MAE 110 gfp выявляли на среде, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт - 5, бак-топептон - 10, агар - 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7.2-7.4. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0.5 атм в течение 30 мин с антибиотиком налидиксовая кислота 50 мг/л. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канамицин 50 мг/л. E. coli O157:H7 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, NaCl - 10, агар - 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7.2-7.4. Среду стерилизовали при повы-

шенном давлении в 0.5 атм в течение 30 мин. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин - 50 мг/л. P. fluorescens 32 gfp выращивали на среде, содержащей г/л: бактопептон - 2; К2НР04 - 1.4; MgSO4 ■ ■ 6H2O - 1.5; глицерин - 15 мл/л; агар - 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7.0-7.2. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0.5 атм в течение 30 мин. После автоклавирования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин - 50 мг/л и рифампицин - 50 мг/л [10].

Биомассу бактерий для интродукции в ЭКРС выращивали в тех же, но жидких средах. Температура выращивания бактерий составляла 37°С для S. Typhimurium MAE 110 gfp и E. coli O157:H7 gfp и 25°С для P. fluorescens 32 gfp.

Экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) были собраны на ферме КРС ЗАО "Московский конный завод № 1" Одинцовского р-на Московской обл. pH ЭКРС 7.1. Рацион кормления животных включал кг/особь/сутки: зеленая масса - 2.5; сено - 1; комбикорм сухой -3.0; соль на зеленую массу - 40 г/особь/сутки. В экспериментах использовали свежесобранные экскременты. Исходная влажность экскрементов в среднем составляла 85%.

Почва. Использовали дерново-подзолистую почву, отобранную в Ботаническом саду МГУ им. М.В. Ломоносова недалеко от растений облепихи (Hippophae rhamnoides L.). В течение нескольких предыдущих лет в почву не вносили органических удобрений. Из минеральных удобрений вносили незначительное количество кристаллической аммиачной селитры (NH4NO3). Почву отбирали с глубины 0-15 см, просеивали через сито с размером ячеек 2 мм и хранили в полиэтиленовом пакете при комнатной температуре, влажность сразу после отбора составляла 6%. Почва содержала: общего углерода - 39.6 мг/г, общего азота - 2.87 мг/г, азота аммонийного - 3.75 мкг/г, азота нитратного - 85.5 мкг/г, фосфора в виде PO4 - 17.7 мкг/г, рН почвы 6.6. Фракционный состав почвы был следующим: (среднее в объемных %): глина -11.65; песок - 31.8 и илистые частицы - 56.55.

Растения. Для выявления способности исследуемых бактерий колонизировать растения использовали кресс-салат (Lepidium sativum) сорта Витаминный, производитель "Агрофирма Аэлита", всхожесть семян 92.5%.

Беспозвоночные животные. Для проверки вероятности выживания исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ беспозвоночных использовали виноградных улиток (Helix pomatia), собранных в Ботаническом саду МГУ. В лаборатории улиток содержали в стеклянных емкостях при 18-20°С, кормили листьями капусты и тонкими срезами моркови.

Определение содержания водорастворимого органического углерода в ЭКРС, почве и их смеси. Проводили водную экстракцию навески ЭКРС (1 г), почвы (1 г) или их смеси, центрифугировали и фильтровали через бактериальный нейлоновый фильтр. Определение С орг проводили после его окисления с раствором K2Cr2O7 в H2SO4 с пересчетом по калибровочной кривой, построенной после проведения серии таких же реакций с разными концентрациями глюкозы.

Инокуляция бактериями ЭКРС. В суспензии выращенных в жидкой среде клеток, находящихся в начальной стационарной фазе роста, определяли численность бактерий учетом под люминесцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, Санкт-Петербургское ОМО). Клетки концентрировали центрифугированием (Backman J 6 B) при 5000 об/мин в течение 20 мин, ^ 4-5°С. Биомассу отмывали один раз дистиллированной водой и ресуспендировали в ди

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Сельское и лесное хозяйство»