научная статья по теме МОДЕЛИРОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ПУТЕЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ К ФОТОСИСТЕМЕ I У ИЗОЛИРОВАННЫХ ТИЛАКОИДОВ Биология

Текст научной статьи на тему «МОДЕЛИРОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ПУТЕЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ К ФОТОСИСТЕМЕ I У ИЗОЛИРОВАННЫХ ТИЛАКОИДОВ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 645-650

УДК 581.1

МОДЕЛИРОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ПУТЕЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ К ФОТОСИСТЕМЕ I У ИЗОЛИРОВАННЫХ ТИЛАКОИДОВ

© 2004 г. Е. А. Егорова, Н. Г. Бухов

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 05.04.2004 г.

У тилакоидов, изолированных из листьев проростков гороха, исследовали кинетику темновой релаксации изменений поглощения при 830 нм (АА830) при различных концентрациях экзогенных НАДФН или НАДН. Изменения поглощения индуцировали дальним красным светом для того, чтобы избежать донирования электронов от фотосистемы II. В присутствии обоих биологических восстановителей кинетика релаксации АА830, отражающая темновое восстановление Р700+, первичного донора электронов фотосистемы I, описывалась моноэкспоненциальной кривой. Скорость восстановления Р700+ возрастала с увеличением концентрации как НАДФН, так и НАДН. Значения Кт и Утах для реакции восстановления Р700+, определенные из концентрационных зависимостей, были найдены равными 105 мкМ ± 21 мкМ и 0.32 с-1 для НАДН или 21 ± 8 мкМ и 0.12 с-1 для НАДФН. В присутствии ротенона, специфического ингибитора хлоропластной редуктазы, сходной с митохондриальным комплексом I, скорость восстановления Р700+ существенно возрастала в присутствии как НАДФН, так и НАДН. При этом, в присутствии ротенона изменялось значение только Утах, тогда как значение Кт практически не изменялось. Сделан вывод о том, что в тилакоидах, в отличие от хлоропластов интактных листьев, присутствует только один фермент, катализирующий вход восстановительных эквивалентов от НАДФН или НАДН в цепь переноса электронов.

Альтернативные пути - дегидрогеназа хлоропластов - тилакоиды - электронный транспорт

Помимо широко известного линейного фотосинтетического транспорта электронов, в который вовлечены фотосистемы (ФС) II и I, в хлоро-пластах интактных листьев открыты несколько альтернативных путей переноса электронов, связанных только с ФС I [1, 2]. В числе последних наибольшее внимание в последнее время привлекает путь, связанный с функционированием специфической дегидрогеназы, катализирующей вход электронов в цепь переноса на уровне пула плас-тохинонов [3-5]. Субстратами для этой дегидрогеназы являются молекулы НАДФН и НАДН, локализованные в строме хлоропласта.

Поскольку пул пластохинонов находится в цепи переноса между двумя фотосистемами, двумя основными приемами исследования донирования электронов от стромальных восстановителей служат измерения возрастания флуоресценции хлорофилла в темноте, связанные с восстановле-

Сокращения: Р700 - первичный донор электронов фотосистемы I, ФС I и ФС II - фотосистема I и фотосистема II, AAg3o -изменения поглощения при 830 нм.

Адрес для корреспонденции: Егорова Елена Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: eea76@mail.ru

нием первичного акцептора ФС II [6, 7] и регистрация кинетики восстановления Р700+, окисленного первичного донора электронов ФС I, после освещения дальним красным светом [8]. У листьев было обнаружено, что кинетика восстановления Р700+ после их экспозиции к дальнему красному свету, двухфазна [9-11].

Было сделано заключение, что двухфазность этой кинетики обусловлена существованием двух независимых популяций ФС I, различающихся способностью воспринимать электроны от стромальных восстановителей [10, 11].

В хлоропластах высших растений гетерогенность ФС I является хорошо установленным фактом [12]. Комплексы этой фотосистемы локализованы как в стромальных ламеллах, так и в концевых участках гран [13]. Предположено, что они функционально различны, в том числе по отношению к способности участвовать в нециклическом и циклическом потоках электронов [14].

С целью выяснить, с каким участком мембранной системы интактного хлоропласта связаны комплексы ФС I, отвечающие за два кинетически различных компонента донирования электронов от стромальных редуктантов, мы исследовали кинетику восстановления Р700+ у изолированных тилакоидов, освещенных дальним красным све-

2J

1.5-

m оо

я

0.5-

0 20 40

Время, с

Рис. 1. Кинетические кривые темнового спада изменений поглощения при 830 нм, индуцированных у изолированных тилакоидов 10-с освещением дальним красным светом, в присутствии 20 и 200 мкМ НАДФ-Н (1 и 3) или 20 и 200 мкМ НАД-Н (2 и 4), представленные в полулогарифмических координатах.

том, в присутствии экзогенных НАДФ-Н или НАД-Н. Поскольку при выделении тилакоидов стромальные ламеллы отделяются от них, локализованные в строме комплексы ФС I не могут вносить вклад в измеряемый сигнал. Кроме того, мы исследовали влияние на кинетику восстановления Р700+ ротенона - известного ингибитора хлоропластной редуктазы, сходной с митохондри-альным комплексом I [7, 15].

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования использовали тилакоиды, изолированные из листьев 10-12-дневных проростков гороха (Pisum sativum L.). Проростки выращивали в почве под люминесцентными лампами белого света (интенсивность 170 мкмоль квантов/(м2 с)). Длительность фотопериода 16 час, температура (день/ночь 20°/18°C).

Тилакоиды изолировали по методу, описанному в [16]. Охлажденные листья растирали в ступке со средой, содержавшей 100 мМ сорбита, 20 мМ Hepes-NaOH буфера (рН 7.8), 10 мМ NaCl и 2 мМ MgCl2. Экстракт фильтровали через 4 слоя нейлона и центрифугировали при 150 g в течение 5 мин. Супернатант затем центрифугировали при 350 g в течение 10 мин. Осадок от последнего центрифугирования ресуспендировали в среде, содержавшей 20 мМ Hepes-NaOH буфер (рН 7.8), 10 мМ NaCl и 2 мМ MgCl2. При измерениях использовали НАДФ-Н, НАД-Н и ротенон фирмы "Sigrna"(CmA).

Измерения изменений поглощения при 830 нм проводили с помощью специализированного прибора PAM ("Walz", Германия), используя пару эмиттер-детектор ED-800T [17]. Измерения проводили в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1.065 мм. Концентрация хлорофилла при измерениях составляла 140 мкг/мл. Для активации оттока электронов от ФС I измерения проводили в присутствии 100 мкМ метилвиологена. В качестве источника дальнего красного света использовали осветитель KL-1500, в который был помещен стеклянный светофильтр RG-9, пропускающий лучи с длиной волны больше 710 нм. Регистрацию сигнала проводили с помощью самописца Servogor 210 ("Servogor", Австрия). Разложение кинетических кривых проводили с помощью компьютерной программы Grafit.

Каждый эксперимент был проведен в 3 по-вторностях. На рисунках представлены данные типичного опыта.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1 представлены полулогарифмические анаморфозы кинетики темновой релаксации АА830 после освещения тилакоидов дальним красным светом в присутствии 20 и 200 мкМ НАДФ-Н (кривые 1 и 3) или 20 и 200 мкМ НАД-Н (кривые 2 и 4). Как следует из рисунка, кинетика восстановления Р700+, которую отражает темновая релаксация АА830, была моноэкспоненциальна в присутствии обоих экзогенных доноров электрона. При этом, во-первых, скорость восстановления Р700+ возрастала при увеличении концентрации НАДФ-Н или НАД-Н и, во-вторых, была выше в присутствии НАД-Н по сравнению с эквивалентными концентрациями НАДФ-Н.

Как показывает рис. 2, на котором представлены константы скорости первого порядка реакции восстановления Р700+ как функция концентраций экзогенных НАДФ-Н или НАД-Н, насыщение притока электронов к ФС I достигалось при более низких содержаниях НАДФ-Н, чем НАД-Н. Максимальная скорость при насыщающих концентрациях восстановителей была значительно выше в присутствии НАД-Н.

На рис. 3 данные по концентрационным зависимостям скорости восстановления Р700+ от содержания экзогенных НАДФ-Н и НАД-Н представлены в координатах Лайнуивера-Бэрка [18]. В обоих случаях концентрационные зависимости, построенные по методу двойных обратных координат, описывались линейной функцией. Рассчитанные значения Кт составляли 105 ± 21 мкМ для НАД-Н и 21 ± 8 мкМ для НАДФ-Н. Значения Утах составляли 0.32 с-1 для НАД-Н и 0.12 с-1 для НАДФ-Н.

[НАДФН, НАДН], мкМ

Рис. 2. Зависимости от концентрации НАДФН (1) или НАДН (2) скорости темновой релаксации изменений поглощения при 830 нм у изолированных тилакоидов после 10-с освещения дальним красным светом.

Время, с

Рис. 4. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых темнового спада изменений поглощения при 830 нм, индуцированных у изолированных тилакоидов 10-с освещением дальним красным светом, в присутствии 20 мкМ НАДФ • Н (1 и 3) или 20 мкМ НАД-Н (2 и 4) в отсутствие (1 и 2) или в присутствии (3 и 4) 100 мкМ ротенона.

Как показывает рис. 4, добавление 100 мкМ ротенона существенно увеличивало скорость восстановления Р700+ в присутствии как НАДФН, так и НАДН. При этом моноэкспоненциальность кинетики восстановления Р700+ не претерпевала изменений.

Ротенон практически не влиял на значение константы Михаэлиса (рис. 5) для восстановления Р700+ при переносе электронов от экзогенного НАД Н, которая в данном опыте составляла 98 мкМ в отсутствие ротенона и 107 мкМ в его присутствии. В то же время, Утах возрастала от 0.34 с-1 до 1.7 с-1 в присутствии 100 мкМ ротенона (рис. 5).

1/[НАДФН], 1/[НАДН]

Рис. 3. Зависимости от концентрации НАДФ-Н (1) или НАД-Н (2) скорости темновой релаксации изменений поглощения при 830 нм у изолированных тилакоидов после 10-с освещения дальним красным светом, представленные в координатах Лайнуивера-Бэрка.

1/[НАДН]

Рис. 5. Представленные в координатах Лайнуивера-Бэрка зависимости от концентрации НАД-Н скорости темновой релаксации изменений поглощения при 830 нм, индуцированные в отсутствие (1) или в присутствии (2) 100 мкМ ротенона 10-с освещением изолированных тилакоидов дальним красным светом.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы можем выделить два основных результата данной работы. Первое, в отличие от интактных листьев, освещенных дальним красным светом, кинетика восстановления Р700+ в присутствии НАДФН или НАДН описывалась в изолированных тилакоидах не двух-, а моноэкспоненциальной кривой. Второе, в отличие от ожидаемого замедления восстановления Р700+ после добавки ротенона, наблюдался существенный рост скорости

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком