Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 3, с. 302-309
УДК 576.524,526; 57.085.23; 543.544.53
МОДЕЛИРОВАНИЕ in vitro ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТКА-НОСИТЕЛЬ © 2011 г. В. А. Коржиков*#, Е. Г. Влах*, К. Каспер**, Т. Б. Тенникова*
*Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В.О., 31;
**Leibniz Universität Hannover, Institut für Technische Chemie, Hannover, Deutchland Поступила в редакцию 21.06.2010 г. Принята к печати 30.08.2010 г.
В ходе моделирования на носителе специфической адгезии клеток с последующим их ростом и образованием костной ткани предложен простой метод контроля эффективности взаимодействия поверхностный лиганд—клеточный рецептор с использованием аффинной хроматографии на макропористых монолитных сорбентах. Биоспецифический пептид GRGDSP выполнял роль адгезионно-активного лиганда на носителе, в то время как функцию клетки имитировали полимерные (полистирольные) микрочастицы с иммобилизованным на их поверхности пептидом EDYPVDIYYLMDLSYSMKDD, представляющим собой часть сайта связывания RGD-последовательности в клеточном интегрине. Таким образом, монолитная ультракороткая колонка (CIM® -диск) представляла собой упрощенную модель носителя (структурного каркаса), обладающего биоспецифическими свойствами. Параметры взаимодействия аффинных партнеров количественно оценивали фронтальным анализом с построением изотерм адсорбции, последующей их линеаризацией и математической обработкой. Полученные данные достоверно указывают на высокоспецифичный характер образования биологических пар, что полностью подтверждается данными экспериментов на культуре клеток.
Ключевые слова: моделирование клеточных взаимодействий, тканевая инженерия, аффинная хроматография.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время огромный интерес исследователей во всем мире вызывает разработка материалов, предназначенных для восстановления костной ткани методом тканевой инженерии [1—3]. Данный метод основан на имплантации ткани пациента, выращенной из его собственных клеток. Для этого клетки высевают на поверхность трехмерного макропористого структурообразующего каркаса. Очевидно, что для направления роста клеток в сторону образования костной ткани, каркас, координирующий рост клеток в пространстве, должен обладать также системой доставки необходимых сигналов, управляющих поведением клеток [4]. Недавно нами была предложена новая стратегия создания гибридных биораспознающих носителей клеток (скаффолдов) для инженерии костной ткани, основанная на адсорбционном покрытии макропористой керамической основы биосовместимыми гидрофильными полимерами, модифицированными биологически-
Сокращения: ВЭ-МДАХ — высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография; ИМ-пептид — интегрин-моделирующий пептид (ББУРУО1¥УЬМВЬ8У8МКОВ); МКМ — межклеточный матрикс; ФСБ — фосфатно-солевой буфер; ВЛР1 — 4',6-диамидино-2-фенилиндолгидрохлорид; ОМЛ-БВМЛ — сополимер глицидилметакрилата с этиленгли-кольдиметакрилатом; ИТС — флуоресцеинизотиоцианат; рМЛО — поли(2-дезокси-2-Лг-метакрилоиламино-!)-глюкоза).
# Автор для связи (тел.: (812)323-04-61; факс: (812)328-68-69; эл. почта: v_korzhikov@mail.ru).
ми молекулами, управляющими поведением клеток [5, 6].
Контролирование механизма и степени адгезии клеток на поверхности каркаса — один из основных аспектов его конструирования. Известно, что в живых тканях специфическая адгезия клеток на поверхности структурных компонентов межклеточного матрикса (МКМ) происходит за счет взаимодействия между клеточными рецепторами — интегринами и специальными белками МКМ. К настоящему времени у белков МКМ, ответственных за адгезию клеток, определены последовательности нескольких коротких пептидов, способных связывать интегрины с высокой специфичностью, не уступающей исходным белкам. При использовании для ковалентной модификации биоматериалов короткие пептиды имеют преимущества перед белками ввиду отсутствия денатурации, меньшей подверженности протеолизу, а также меньшей их иммуногенности [7, 8]. Наибольший интерес представляют пептиды, содержащие последовательность ЯСЭ (Лг§-С1у-Л8р; ЯСО-пептиды), поскольку модификация биоматериала ЯСО-пептидами приводит к увеличению адгезии клеток и активирует каскад биохимических реакций, обусловленный специфическим связыванием пептидов с интегри-нами. Использование ЯСО-пептидов как факторов специфической адгезии клеток на различных искусственных каркасах неоднократно описано в литературе [8-10].
Учитывая сказанное выше, актуальным вопросом при химическом конструировании искусственного МКМ (каркаса) является сохранение активности того или иного RGD-пептида при его иммобилизации на поверхности биоматериала. Очевидно, что биологический ответ системы in vivo на введение тех или иных биомолекул наилучшим образом характеризует их активность. Тем не менее определение параметров взаимодействия биомолекул с клеточными рецепторами можно провести только in vitro.
Известно, что скоростная аффинная хроматография на ультракоротких монолитных колонках предоставляет исключительные возможности для моделирования и изучения in vitro процессов специфического комплексообразования в динамических условиях [11, 12]. Недавно метакрилатные монолиты на основе сополимера глицидилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (GMA-EDMA) были использованы нашей группой для моделирования межфазовых процессов, построенных на динамической адсорбции крупных частиц, выступающих в качестве моделей вирусов [13, 14]. По аналогии, взаимодействие клетки, содержащей на поверхности интегриновые рецепторы, с носителем, на поверхности которого иммобилизован RGD-пептид, также происходит на границе раздела фаз, когда один из аффинных партнеров располагается в мембране клетки, находящейся в потоке биологической жидкости, а второй является поверхностным компонентом стационарной фазы. Для моделирования данного процесса предлагается использовать высокоэффективную монолитную дисковую аффинную хроматографию (ВЭ-МДАХ), где в качестве активной RGD-последовательности служит пептид GRGDSP, способный, как известно [15], взаимодействовать с интегриновыми рецепторами стволовых клеток — предшественников клеток костной ткани.
Целью данного исследования является характеристика модели аффинного взаимодействия клетка—носитель методом ВЭ-МДАХ на ультракоротких монолитных колонках (дисках). Для создания приближенной модели клеток с одним рецептором была использована пептидная последовательность EDYPVDIYYLMDLSYSMKDD, ответственная за взаимодействие с RGD-последовательностью вит-ронектина, иммобилизованная на поверхности карбоксилсодержащих полистирольных латексных частиц.
Результаты, полученные при моделировании системы, сравнивали с данными экспериментов в культуре клеток с GRGDSP-пептидом, иммобилизованным на поверхности керамической макропористой матрицы Sponceram®.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Схема проведенного модельного эксперимента представлена на рис. 1.
Первая стадия заключалась в получении физико-химической модели клетки с интегриновыми рецепторами. При этом пептидная последовательность, используемая для моделирования клеточных рецепторов, должна соответствовать определенному типу клеток, используемых для выращивания костной ткани. Наиболее перспективными являются недифференцированные, т. е. стволовые клетки, а также клетки — предшественники остеобластов. На основании анализа последовательностей внеклеточных участков интегриновых рецепторов, являющихся сайтами связывания ЯОЭ-лигандов, была выбрана 20-членная пептидная последовательность Р-субъ-единицы интегрина стволовых клеток, а именно, пептид ЕПУРУОГУУЬМВЬ8У8МКОВ [15], ответственный за взаимодействие с ЯОЭ-последователь-ностью витронектина. Далее в тексте данный пептид обозначается как интегринмоделирующий пептид (ИМ-пептид).
При моделировании клетки необходимо использовать частицы, имитирующие ее физико-химические параметры. Несомненным преимуществом использованных нами латексных частиц является их стабильность (в отличие от липосом) и монодисперсность. Наличие на поверхности частиц карбоксильных групп, пригодных для связывания ИМ-пептида, позволяет придавать модели способность к аффинному взаимодействию с соответствующим партнером. Для создания упрощенных моделей клеток с одним рецептором (ИМ-пептидом) были использованы полисти-рольные монодисперсные латексные частицы с карбоксилированной поверхностью, полученные безэмульгаторной полимеризацией стирола в присутствии карбоксилсодержащего азоинициатора, а именно, азо-5ис-4-циановалериановой кислоты [16]. Ковалентную иммобилизацию ИМ-пептида на поверхности указанных частиц проводили двуста-дийным методом активации функциональных групп [14]. Метод активированных эфиров осуществляли с использованием 1-гидроксибензотриа-зола и водорастворимого карбодиимида в буферном растворе ^-2-гидроксиэтилпиперазин-^-этансуль-фоновой кислоты (МЕ8-буфер, рН 5.5). Иммобилизацию пептида по концевой а-аминогруппе проводили в 0.01 М натрий-боратном буфере при значении рН 8.2, оптимальном для иммобилизации пептидов по а-аминогруппе.
С целью максимального соответствия создаваемой модели клетки биологическому объекту было необходимо определить условия, при которых наибольшее количество карбоксильных групп будет амидировано ИМ-пептидом. Для определения степени конверсии карбоксильных групп латексных частиц при связывании ИМ-пептида, его предвари-
Латекс й = 100 нм
О-
МЕ$-буфер, рН 5.5
Латекс й = 100 нм
О
оч
СО2Н
1. + НОВ! (активация СО2Н-групп)
2. + ЕБУРУБГУУЬМБЬ8У8МКОБ (ИМ-пептид) + ЕБС
3. Диализ Н2О, ФСБ рН 7.0
Модель клетки с интегриновыми рецепторами
Н
ЕБУРУБГУУЬМБЬ8У8МКОБ
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
О.
Н
+ аяаБ8Р
СГМ-диск
натрий-боратный буфер рН 10.0
акаБЯР
&
СГМ-диск
Модель каркаса с иммобилизованным на нем ЯОБ-пептидом
Рис. 1. Схема эксперимента, моделирующего специфическое взаимодействие ОКОВ8Р-пептида и клеточного инте-грина (пептидного сайта связывания ЯОВ-лиганда) методом аффинной хроматографии. ЕВС — водорастворимый карбодиимид, НОВ! — 1-гидроксибензотриазол, СГМ-диск — макропористый мета
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.