БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 4, с. 379 - 412
УДК 577.355.3
МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА а: СВЯЗЬ С ФОТОСИНТЕЗОМ
Обзор
© 2014 A. Штирбет1, Г.Ю. Ризниченко2, AX. Рубин2, Говинджи3*
1 Newport News, 204 Anne Burras Lane, VA 23606, USA;
E-mail: sstirbet@gmail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-1115,
электронная почта: riznich@biophys.msu.ru, rubin@biophys.msu.ru 3 Departments of Plant Biology and Biochemistry and Center of Biophysics and Quantitative Biology, 265 Morrill Hall, 505 South Goodwin Avenue, Urbana, IL 61801, USA;fax: (217)244-7246, E-mail:gov@illinois.edu
Поступила в редакцию 20.12.13
В честь академика Александра Абрамовича Kрасновского мы представляем обзорную статью о связи кинетики флуоресценции хлорофилла а с различными процессами фотосинтеза. Первым событием оксигенно-го фотосинтеза является поглощение света хлорофиллами (Хл), каротиноидами и, в некоторых случаях, фи-кобилинами; эти пигменты формируют антенну. Большая часть энергии переносится на реакционные центры, в которых она используется для первичного разделения зарядов. Малая часть энергии, не использующаяся в фотохимических реакциях, рассеивается в тепло или испускается в форме флуоресценции. ^гда фо-тосинтезирующий образец переносят из темноты на свет, интенсивность флуоресценции Хл а (ИФХ) изменяется во времени характерным образом. Это т.н. кинетика флуоресценции или OJIPSMT-кинетика, где O (origin) — это первый измеренный минимальный уровень флуоресценции, J и I — промежуточные перегибы, P (peak) — пик, S (semi-steady state) — квазистационарный уровень, M — максимум и T (terminal) — конечный стационарный уровень. Такая кинетика является характерным «отпечатком», или «росписью», фотосинтеза, поскольку с ней могут быть связаны различные явления, например, изменения окислительно-восстановительных состояний компонентов линейного транспорта электронов, вклад альтернативных путей переноса электрона, формирование трансмембранного градиента pH и мембранного потенциала, активация различных нефотохимических процессов тушения, активация цикла Kальвина—Бенсона и другие процессы. В данном обзоре мы представляем наши взгляды на то, как различные фотосинтетические процессы влияют на участки OJIPSMT-кинетики и обсуждаем исследования, посвященные математическому моделированию кинетики ИФХ. Особое внимание мы уделяем более медленной фазе PSMT, которой в последнее время было посвящено много работ, но которая менее изучена, чем быстрая фаза OJIP.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: флуоресценция хлорофилла а; эффект ^утского; математическое моделирование; нефотохимическое тушение (НФХТ) возбужденного состояния хлорофилла; пул пластохинонов; переходы между состояниями.
Обзор посвящен памяти Александра Абрамовича Красновского (1913—1993), признанного во всем мире пионера «фотобиохимии», настоящего академического гиганта. В своем докладе в Москве в Российской академии наук 10 октября 2013 г. в столетную годовщину рождения академика Красновского Говинджи сказал, что «он всегда обгонял свое время»». В 1948 г. А.А. Краснов-ский открыл обратимое фотохимическое восстановление хлорофилла аскорбиновой кислотой — первую обратимую фотохимическую ре-
* Адресат для корреспонденции.
акцию хлорофилла (впоследствии она стала известна как реакция Красновского). В 1956 г. Красновский с сотр. открыли различные спектральные формы хлорофилла а in vivo. Значительно позже другие ученые, включая Говинджи (один из соавторов данного обзора), показали, что эти формы принадлежат двум разным фотосистемам. К 1963 г., задолго до того, как термин «искусственный фотосинтез» стал общепринятым, Красновский показал, что хлорофилл может быть использован в модельных системах как переносчик электронов. К 1977 г. В.В. Климов, А.В. Клеваник и В.А. Шувалов, работавшие с
А.А. Красновским, показали, что феофитин является акцептором электронов фотосистемы II, предшествующим акцептору пластохинону QA. В 80-е годы XX в. в научной группе Красновско-го широко применяли липосомальные системы и смогли использовать метилвиологен в качестве акцептора электронов; но самое важное, группе удалось показать выделение водорода в присутствии бактериальной гидрогеназы — вновь обогнав свое время, как отметил Говинд-жи в своем выступлении в Москве.
Академик А.А. Красновский был не только выдающимся ученым, но и талантливым художником. В его честь мы представляем уникальную фотографию зеленых листьев Ficus micro-carpa и испускаемой ими красной флуоресценции, предмета данного обзора. (Подробности представлены в подписи к рисунку; фотография и описание принадлежат Е. и М. Максимовым; см. цветную вклейку).
В организмах, способных к оксигенному фотосинтезу (высших растениях, водорослях и ци-анобактериях), две фотосистемы (ФС), ФС1 и ФС11, работают вместе для того, чтобы окислить воду до кислорода, восстановить никотинамид-динуклеотидфосфат (НАДФ+) и синтезировать АТФ, которые вместе с НАДФН используются в цикле Кальвина—Бенсона фиксации CO2 и других ассимиляционных процессах (рис. 1; см. цветную вклейку). ФС11 окисляет воду и восстанавливает цитохром [1, 2], а ФС1 окисляет восстановленный цитохром и восстанавливает НАДФ+ [3]. Протон-движущая сила (ПДС), т.е. градиент pH (ApH) и мембранный потенциал (A¥), формирующиеся на тилакоидной мембране в процессе фотосинтетического электронного транспорта (ФЭТ), используются для синтеза АТФ АТФ-синтазой. Основы оксигенного фотосинтеза изложены в работах [4—7], а основные понятия флуоресценции хлорофилла (Хл) а — в соответствующих главах в книгах [8] и [9].
Первым событием оксигенного фотосинтеза является поглощение света хлорофиллами (Хл), каротиноидами (Кар) и фикобилинами (в циа-нобактериях и красных водорослях); эти пигменты интегрированы в светособирающие комплексы (ССК) или фикобилисомы — антенные системы. Энергия возбуждения быстро и эффективно переносится по антенне и достигает реакционных центров (РЦ), в которых протекают фотохимические процессы (т.е. разделение зарядов). Малая часть энергии возбуждения, не использующаяся в фотохимических реакциях, переходит в тепло (внутренняя конверсия) или испускается в форме флуоресценции (2—10%) [10]. Поскольку эти три процесса: фотохимичес-
кие реакции, диссипация в тепло и флуоресценция, не являются независимыми и конкурируют друг с другом, выход флуоресценции содержит информацию об эффективности двух других процессов. В высших растениях и зеленых водорослях при комнатной температуре спектр флуоресценции хлорофилла имеет пик при 685 нм (относящийся, в основном, к светособирающей антенне ФСП) и широкое «плечо» между 700 и 750 нм (включающее вклады колебательных подуровней испускания Хл а ФС11 и испускания Хл ФС1). В фикобилисомах (ФБС) и содержащих Хл а бактериях в сигнал флуоресценции вносят вклад дополнительные пигменты (С-фи-коцианин (СФЦ) и аллофикоцианин ^ФЦ)), поскольку перенос энергии возбуждения от них на Хл а меньше 100%. Более того, цианобакте-рии (за исключением прохлорофитов) не содержат Хл b, и соотношение между ФС1 и ФС11 у них составляет от 3 до 5 [11], тогда как в зеленых водорослях и высших растениях это соотношение ближе к 0,6—1 [12].
Эффект Каутского: кинетика флуоресценции хлорофилла. Каутский и Хирш [13] (также http:// www.fluoromatics.com/kautsky_effect.php) показали, что в отличие от флуоресценции Хл а в растворе, интенсивность флуоресценции Хл а (ИФХ) in vivo при равномерном возбуждении светом непостоянна и изменяется во времени характерным образом. Процесс изменения называется индукцией, или кинетикой, флуоресценции; это явление стало известно как эффект Каутского. Индукционная кривая флуоресценции хлорофилла а является характерным «отпечатком» фотосинтеза, поскольку с ней связаны многие события фотосинтеза [14—25]; и соответствующие главы в книгах [9, 26—28].
Кинетику ИФХ измеряют, в основном, с помощью двух типов флуориметров. В первом типе приборов используется модулированный свет (прибор PAM (Pulse Amplitude Modulation), импульсная амплитудная модуляция и возбуждающий свет, имеющий определенную частоту, которая предпочтительно регистрируется детектором света. Во втором типе приборов для возбуждения используется немодулированный (непрерывный) свет (прибор PEA (Photosynthetic Efficiency Analyser), анализатор эффективности фотосинтеза, Hansatech, Кингс-Линн, Норфолк, Великобритания). Помимо указанных выше флуориметров используют приборы с быстроповторяющимися вспышками (fast repetition rate, FRR), с накачкой и зондированием (pump and probe, P&P), с накачкой в ходе зондирования (pump during probe, PDP), с индукцией и релаксацией флуоресценции (fluorescence induction and relaxation, FIRe), с фоновым гра-
диентом освещения и импульсными вспышками (background irradiance gradient single turnover, BIG-STf), и флуориметры с усовершенствованными лазерами (advanced laser fluorometers, ALF) [29]. Существует еще один метод, в котором в качестве источника актинического света для физиологических исследований с помощью флуориметра PAM используется контролируемое компьютером освещение [30]; данный подход предоставляет беспрецедентные возможности контроля различных характеристик актинического светового поля. Для каждого из перечисленных выше методов были разработаны особые протоколы анализа флуоресценции [21, 23, 31—33]. В обзоре будут обсуждаться преимущественно кривые индукции флуоресценции хлорофилла, измеряемые с помощью прямой флуорометрии (несколько примеров кинетики ИФХ, измеренной для разных фотосинтетических организмов, представлено на рис. 2).
Переменная и постоянная флуоресценция. Считается, что переменная флуоресценция (хлорофилла) испускается антенной ФС11, в то время как флуоресценция ФС1 считается постоянной. Более того, постоянная составляющая флуоресценции ФС11 имеет значительно больший выход, чем флуоресценция ФС1 [34—36]; вклад ФС1 в общий сигнал флуоресценции зависит от соотношения ФС1/ФС11 и длины волны, при которой производится измерение ФС1 [37]. Флуоресценция ФС1 при комнатной температуре при из
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.