БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 2, с. 102-109
УДК 577.1
МОДЕЛИРОВАНИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В РЕЖИМЕ ДЕТЕКЦИИ НА ПОВЕРХНОСТИ ЕДИНИЧНОЙ КЛЕТКИ
© 2015 г. А. В. Степанов1,2*, Д. Ксие4, М. А. Дронина1, В. Д. Кнорре1, А. А. Белогуров1,2,3, С. М. Деев1, А. Г. Габибов1,2,3
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; *электронная почта: stepanov.aleksei.v@gmail.com 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18 3Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5 4Научно-исследовательский институт Скриппса, СА 92037, Ла-Хойя, США Поступила в редакцию 14.11.2014 г.
Одной из важнейших мишеней современных фармакологических препаратов является система поверхностных клеточных рецепторов. Взаимодействия рецепторов с их лигандами и корецепторами вовлечены в процессы передачи сигнала в клетку, они играют исключительно важную роль в жизни любой клетки. Взаимодействие рецептора и его лиганда с последующей передачей сигнала путем активации рецептора зачастую практически невозможно изучать в силу методических ограничений воспроизведения условий подобных взаимодействий на поверхности клетки. В связи с этим разработка новых фармакологических препаратов, действие которых направлено на функционирование рецепторов и их акцепторных доменов, требует создания эффективных скрининговых систем, максимально воспроизводящих условия, необходимые для проявления биологической активности исследуемого терапевтического агента. Для решения данной задачи нами предложена универсальная платформа, позволяющая изучать взаимодействия рецепторов и их лигандов в формате одной клетки непосредственно на поверхности клеточной мембраны. С этой целью был получен ряд генетических конструкций, на основе химерных антигенных рецепторов, способных активировать репортерные Т-клетки. В представленной работе доказана применимость данной системы для анализа взаимодействия рецептора с растворимым лигандом, а также лигандом, заякоренным на поверхностной мембране клетки. На примере ex vivo взаимодействия вариабельного домена анти-myc-антитела в составе химерного рецептора и пептида myc, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина, заякоренного мембране клетки, показано, что химерный рецептор взаимодействует с myc-эпитопом, что приводит к активации Т-клеток. Добавлением лиганда во внеклеточную среду показана применимость метода для анализа взаимодействий трансмембранно заякоренных рецепторов с растворимыми лигандами. В дальнейшем, заменив антитело и антиген другой парой акцептор-лиганд, можно детектировать взаимодействие данных молекул непосредственно на поверхности клетки. Полученные доказательства эффективности работы предложенной платформы позволят осуществлять широкомасштабные скрининговые исследования фармакологических препаратов на мембранах клеток ex vivo.
Ключевые слова: лиганд-рецепторные взаимодействие; клеточная мембрана; химерный рецептор; репортерные Т-клетки.
Б01: 10.7868/80233475515020097
ВВЕДЕНИЕ
Лиганд-рецепторные взаимодействия являются основополагающими в процессах передачи сигнала и функционирования клеток [1], поэтому получение терапевтических агентов, действую -щих на систему клеточных рецепторов, считается одним из важнейших направлений разработки современных фармакологических препаратов [2]. Различными исследовательскими группами до-
стигнуты значительные успехи в изучении взаимодействий мембранных рецепторов с их лигандами методами рентгеноструктурного анализа [3, 4], ЯМР-спектроскопии [5, 6] и подходами молекулярной динамики [7]. Воспроизведение условий взаимодействия исследуемого терапевтического агента с рецептором и определение его биологической активности в формате широкого скрининга является неразрешимой задачей при ис-
пользования всех перечисленных методов. В этой связи крайне актуальна и важна разработка новых подходов к изучению лиганд-рецепторных и ре-цептор-рецепторных взаимодействий в условиях, наиболее приближенных к реальным.
В последнее время широкое распространение получили технологии, связанные с исследованием взаимодействий в формате одной клетки ("single cell approach") [8]. Современные биоинженерные и клеточные технологии позволяют создавать эффективные платформы для разработки диагностических и терапевтических, "персонифицированных" подходов к решению проблемы опухолевой трансформации и аутоиммунных процессов [9—11]. Гипервариабильность семейства иммуноглобулинов предоставляет уникальную возможность применять методы комбинаторной химии и биологии для создания на их основе новых диагностических и терапевтических лекарственных технологий [12].
В терапии лимфопролиферативных заболеваний все большую популярность приобретает применение Т-клеток, модифицированных химерным антигенным рецептором Т-клеток (CAR, chimeric antigen receptor) [13, 14]. CAR — рекомби-нантный рецептор, специфичный к уникальному поверхностному антигену клетки-мишени. CAR состоит из двух ключевых частей — фрагмента антитела или, наоборот, лиганда, высокоаффинного
по отношению к поверхностному рецептору клетки-мишени, и сигнального домена, который включает в себя фрагменты рецепторов активации Т-клеток [15]. Ранее была показана принципиальная возможность применения CAR для скрининга библиотеки одноцепочечных антител и разработки новых терапевтических препаратов [16].
В настоящей работе мы предлагаем систему, основанную на применении химерных рецепторов для создания универсальной платформы, позволяющей изучать взаимодействия рецепторов и их лигандов ex vivo. Так как рецептор может взаимодействовать как с лигандом, находящимся во внеклеточной среде, так и с заякоренным на мембране клетки, нами были протестированы оба возможных варианта применения данной системы.
Предлагаемый подход может быть использован в разработке потенциальных лекарственных препаратов, в частности при проведении широкоформатного анализа взаимодействий рецепторов и их лигандов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Создание генетических конструкций. Нуклео-тидная последовательность, кодирующая химерный антигенный рецептор Т-клеток
(GTCGACTACAAAGATGACGATGACAAAGCGAAGCCAACAACCACCCCGGCGCCTAGACCTCCAACT
CCCGCCCCCACTATTGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCTGAGGCTTGCAGACCCGCAGCAGG
GGGCGCAGTTCACACGAGAGGTCTTGATTTCGCCTGCGACTTCTGGGTCCTGGTCGTGGTGGGGG
GGGTGTTGGCCTGTTATAGCCTGCTGGTGACTGTCGCCTTCATTATATTTTGGGTGAGATCCAAAAGA
TCCCGGCTGCTCCATTCTGACTACATGAACATGACTCCAAGGCGACCAGGACCTACTAGAAAGCATTAT
CAGCCGTACGCTCCACCCCGGGATTTTCCGGCTTATCGAAGTAGGGACCAGAGATTGCCCCCTGAC
GCCCACAAGCCTCCCGGGGGGGGAAGCTTCCGCACCCCCATCCAGGAAGAACAAGCAGATGCACAT
AGTACTCTGGCCAAAATAAGAGTGAAGTTTTCTAGAAGCGCAGACGCACCAGCTTACCAGCAGGGCC
AAAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGAGGGAGGAATACGATGTGCTGGATAAGCGCC
GGGGCCGCGATCCCGAAATGGGCGGCAAGCCACGGCGAAAGAATCCTCAGGAGGGACTGTACAAC
GAACTCCAAAAGGACAAGATGGCGGAGGCATACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAAAGACGGCG
GGGCAAGGGGCATGACGGTCTGTATCAAGGGTTGAGTACCGCCACAAAGGATACCTACGACGCCCT
TCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA),
была получена методом твердофазного синтеза ^епеСш^ Люксембург). Синтетическая ДНК была обработана эндонуклеазами рестрикции ЕсоШ/ВашШ, а затем лигирована с обработанным аналогичными рестриктазами плазмидным вектором рЕУ2 (С1оП;есИ, США). Полученную генетическую конструкцию рЕУ2-САЯ использовали в дальнейшей работе.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая флуоресцентный белок шСИеггу, получена путем ПЦР-амплификации гена шСНвгту с применением специфических праймеров
(AATTCGGCGGCCCAGCCGGCCATGGTGAG CAAGGGCGAGGA;
TAGCCAGGCCCCCGAGGCCTGACTTGTACA GCTCGTCCA)
и плазмидного вектора р1У2-тСИепу^Р120, созданного ранее в нашей лаборатории. Полученный ПЦР-продукт был обработан эндонуклеазой рестрикции SШ, а затем лигирован с обработанной аналогичным ферментом конструкцией pLV2-CAR.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный домен антитела Е9Н
(GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTCACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAG
ACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTGGTAGTCGTGGTACTTACACCCACTATCCAGACA
GTGTGAAGGGACGATTCACCATCTCCAGAGACAATGACAAGAACGCCCTGTACCTGCAAATGA
ACAGTCTGAAGTCTGAAGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAAGAAGTGAATTTTATTACTA
CGGTAATACCTACTATTACTCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAGCCTCAGTCACCGTCTC
CTCAGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTATCTCTAGGACAGAGGGCCAC
CATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTATGGCTTTAGTTTTATGAACTGGTTCCAG
CAGAAACCAGGACAGCCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTATATCCAACCGAGGATCCGGGGTC
CCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTGTAGA
GGAGGATGATCCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAACTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGGTG
GAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG),
была получена методом твердофазного синтеза (GeneCust, Люксембург). Синтетическая ДНК была обработана эндонуклеазой рестрикции SfiI, а затем лигирована с обработанным аналогичной рестриктазой плазмидным вектором pLV2-CAR.
Плазмидный вектор pLV2-Fc-MTA, содержащий ген константного домена антитела (CH2-CH3), слитый с трансмембранным доменом рецептора фактора роста PDGFRB, был любезно предоставлен профессором Р. Лернером (The Scripps Research Institute, США). Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид myc, была амплифицирована методом ПЦР из специфических взаимно перекрывающихся двух внешних и двух внутренних праймеров
(GAATTCGTCGACGCTAGCTCCGGAGGTGGA GGATC;
GAGGAAGTGTACACTCGCAGGGTACCGTCGA CGCTA;
CACCACTTCCACCACCACCGGATCCTCCACCT CCGG;
GAAGCGATCGGAGCCACCACCACCACTTCCA CCACC).
ПЦР-продукт ресщепляли эндонуклеазами EcoRI/ NheI, а затем лигировали с обработанным рестрик-тазами EcoRI/NheI вектором pLV2-Fc-MTA.
Получение лентивирусных частиц. Конструкции pLV2-mCherry-CAR, pLV2-E9H-CAR, pLV2-myc-Fc-MTA в дальнейшем использовали для трансфекции клеток линии HEK293T и продукции соответствующих вирусных частиц. Для этого за день до трансфекции клетки HEK293 рассевали в лунки шестилуночного планшета (Nunc) в концентрации 0.5 млн/мл. При достижении 80% кон-флюентности клетки трансфицировали методом липофекции с помощью набора Lipofectamine LTX (Invitrogen). Для получения вирусных частиц перед трансфекцией к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.