БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 6, с. 1061-1070
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
МОДЕЛИР ОВАНИЕ МЕХАНО ХИМИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК ПОД ДЕЙСТВИЕМ УЛЬТР АЗВУКА
© 2014 г. Д.Ю. Нечипуренко*, И .А. Ильичева**, М.В. Ходыков**, М.С. Попцова*,
Ю.Д. Нечипуренко* **, С.Л. Гроховский**
*Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, 1;
**Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 E-mail: grok@eimb.ru, imb_irina@rambler.ru, песк@ешЬ.т Поступила в p едакцию 28.07.14 г.
Пpоведено модел^ование динамики pаcтяжения фpагмента двойной cпиpали ДНК в высо-когpадиентном течении жидкости вблизи cxлопывающиxcя кавитационных пузьфьков. Рассчитанные ^офили изменения упpугиx напpяжений вдоль модели фpагмента полимеpа использованы для pаcчета cкоpоcтей меxаноxимичеcкого pасщепления в pазличныx позицияx pеcтpиктныx фpагментов ДНК. Полученные модельные ^офили cкоpоcтей pаcщепления ка-чеcтвенно cоглаcуютcя c пpофилями интенcивноcтей ультpазвукового pа cщепления pеcтpиктныx фpагментов ДНК, полученными экcпеpиментально. Пpедложенная модель позволяет также cвязать экcпеpиментально обнаpуженную нами pанее cпецифичноcть ультpазвукового pаcще-пления ДНК к нуклеотидной поcледовательноcти c особенностями локальной конфоpмационной динамики P-D-дезокcиpибозы в В-фоpме двойной cпиpали. Количественные оценки cкоpоcтей ультpазвукового pасщепления ДНК для pазличныx конфоpмационныx cоcтояний P-D-дезок-cиpибозы, полученные на остове пpедложенного подxода, качественно cоглаcуютcя c экспе-pиментальными данными.
Ключевые слова: расщепление ДНК под действием ультразвука, акустическая кавитация, меха-нохимическое расщепление полимеров, контекстно-зависимые свойства ДНК, конформационная динамика ДНК, псевдовращение цикла P-D -дезоксирибозы.
П pи анализе пpодуктов ультpазвукового pаcщепления pеcтpиктныx фpагментов ДНК c помощью электpофоp еза в полиакpиламидныx геляx [1] было впеpвые обнаpужено явление cпецифичноcти pаcщепления: веpоятноcть дву-нитевыx pазpывов завиcит от последовательно-cти нуклеотидов. Были опpеделены характерные cвойcтва пpоцеccа, котоpые указывают на его меxаноxимичеcкую пpиpоду. А именно: ско-pоcти pаcщепления в pазныx учаcткаx рестрикт-нык фpагментов завиcят от иx pаccтояния до концов (позиционная завиcимоcть), общий уpо -вень pа cщепления падает c p оcтом темпеpатуpы, а увеличение вязкости pаcтвоpа пpи добавлении глицеpина, напротив, его повышает. Уpовень pаcщепления завиcит также от pН и ионной силы pаcтвоpа. Xаpактеp этиx завиcимоcтей одинаков пp и использовании ультpазвука c частотами 22 и 44 кГц. Коpоткие (менее 20 п. о.) олигонуклеотиды не pаcщепляютcя. Показано также, что фоcфатная гpуппа оcтаетcя на 5'-конце обpазующиxcя фpагментов и наиболее часто двойная cпиpаль p азpываетcя по динук-леотиду d(CpG).
Более детальное экcпеpиментальное изучение этого явления позволило получить базу данныx для веpоятноcтей pаcщепления различ-нык динуклеотидов и тетpануклеотидов [2,3]. К pоме того, была обнаpужена коppеляция между веpоятноcтью pаcщепления межнуклеотид-ной cвязи и интенcивноcтью N^S-пеpеxодов цикла Р^-дезокcиpибозы в 5'-концевом нук-леозиде pаcщепляемого динуклеотида. Механо-xимичеcкий xаpактеp пpоцеccа был подтвержден полученной экcпеpиментальной кpивой зависимости веpоятноcти pаcщепления ДНК от pаccтояния межнуклеотидной связи до концов фрагмента (см. рис. 1).
Для анализа физической природы этого явления в настоящей работе мы провели численное моделирование и оценили механические напряжения, приходящиеся на межнуклеотидные связи в высокоградиентном течении жидкости вблизи схлопывающихся кавитационных пузырьков.
Рис. 1. Типичный профиль вероятностей ультразвукового расщепления рестриктного фрагмента ДНК длиной 218 пар оснований, полученный в результате обработки электрофоретической картины после разделения на полиакриламидном геле. Высота столбца пропорциональна концентрации соответствующего фрагмента ДНК, образующегося в результате ультразвукового расщепления, а его цвет - типу нуклеозида, за которым происходит разрыв (в направлении от 5'- к 3'-концу цепи). Видно увеличение вероятности расщепления в центральной части рестриктного фрагмента ДНК и уменьшение - к его концам. Рисунок демонстрирует также специфичность расщепления к последовательности: заметно увеличение вероятности расщепления фосфодиэфирной связи, соединяющей дезоксицитидин со следующим по цепи нуклеозидом (т.е. увеличение высоты столбцов, соответствующих дезоксицитидину).
Рис. 2. Иллюстрация к модели расщепления полимеров под действием акустической кавитации. П ри схлопывании кавитационного пузырька радиуса Я жидкость устремляется к центру пузырька. Скорость движения жидкости имеет максимальное значение у поверхности пузырька и уменьшается с ростом расстояния от поверхности пузырька. Наличие градиента скорости течения жидкости приводит к тому, что скорости течения на противоположных концах полимера различны. Это приводит к возникновению растягивающего усилия ¥ в полимере, имеющего максимальное значение в центре молекулы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мы использовали модель Томаса, которая в настоящее время принята для объяснения ультразвуковой деградации полимеров в жидкости в условиях кавитации [4]. Разрыв молекулы полимера в среде, допускающей кавитацию при ультр азвуковом облучении, согласно данной модели, происходит благодаря высоко-
му градиенту скор ости течения жидкости вблизи пульсирующих и схлопывающихся кавита-ционных пузырьков. Гр адиент скоро сти течения вызывает растягивающее усилие в протяженных молекулах, оказавшихся в некоторой окрестности кавитационных пузырьков (см. рис. 2).
Оценка величин градиента скоро сти течения жидкости, характерных для экспериментов по расщеплению ДНК ультразвуком [3,5,6], была получена на основе анализа динамики кавита-ционного пузырька, описываемой уравнением Рэлея-Плессета:
Яй2Я 3//Я
йг2 + 21 йг
Р - Р - 2а - 4ц/йЯ 1 ~ Я ЯI йг
(1)
где Я - радиус кавитационного пузырька, г -время, р - плотность жидкости, а - поверхностное натяжение, ц - вязкость жидкости, Р1 -давление газа внутр и пузырька, а - давление окружающей пузырек жидкости. Численные значения параметров при температуре воды 0-5°С: а = 75-10-3 Н/м, ц = 1,7 мПас, р = 103 кг/м3 (справочные данные).
Учитывая малые размеры пузырька по сравнению с длиной ультразвуковой волны, изменение давления окружающей пузырек жидкости можно описать гармонической функцией: Р ^ = Р0 - Р Асо8(2л/г), где Р 0 = 105 Па - атмосферное давление, Р А = 2,4-105 Па - амплитуда давления в ультразвуковой волне, / = 22 кГц - частота
2
Рис. 3. Зависимость радиального градиента скорости течения жидкости О вблизи кавитационного пузырька на второй (промежуточной) стадии схлопывания от расстояния до поверхности пузырька d и времени г.
ультразвука в экспер именте. Величина Р А связана с интенсивностью ультразвуковой волны уравнением Ра = л/2/рс, в котором I - интенсивность ультразвуковой волны, принятая равной 2 Вт/см2, с = 1480 м/с - скор ость звука в воде.
Для описания сжатия газа в пузырьке было использовано адиабатическое приближение
Р = Р,
(К \ К о
3у
ю
К
V /
где Р ¡о - давление насыщенного пар а в пузыр ьке в момент, когда его р адиус принимает максимальное значение К о ~ 80 мкм, у - экспериментальный показатель адиабаты для водяного пар а, равный 1,3. Адиабатическое приближение, используемое в расчетах, позволяет получить оценку «сверху» для величины внутреннего давления газа в пузырьке, которое является единственным активным фактором, противодействующим сжатию пузыр ька. Как показано в ра -боте [7], учет явлений тепло- и массопереноса при схлопывании пузырька приводит к более высоким значениям скорости схлопывания, а значит, и большим величинам радиального гра -диента скорости течения жидкости.
В зависимости от значения начального ра -диуса пузыр ька К о возможны два варианта динамического поведения: 1) если радиус пузырь-
ка меньше критического значения К с = 2</(Ра -Ро + Р{) ~ 1 мкм, то пузырек схлопнется под действием поверхностного натяжения; 2) если радиус пузырька больше Кс, то пузырек начнет раздуваться под действием отрицательного внешнего давления. Важно отметить, что при К о > К с максимальный радиус пузыр ька К т слабо зависит от начального значения К о.
Результаты численного интегрирования уравнения (1) методом Рунге-Кутты четвертого порядка с шагом по времени Дг = Ю-1° с были использованы для вычисления радиального градиента скорости течения жидкости в окр ужаю-щем пузырек пространстве. Из условия несжимаемости жидкости следует:
О =
дг
2 г3
dR dг
(2)
где О - абсолютное значение радиального гра -диента скор ости течения жидкости, V - р ади-альная скорость жидкости на расстоянии г от центра пузырька (г > К).
На рис. 3 приведены результаты расчета градиента скорости течения жидкости вблизи схлопывающегося кавитационного пузырька. Видно, что градиент скорости течения уменьшается с ростом расстояния до центра пузырька и растет по мере его схлопывания.
В используемой модели скор ость движения поверхности пузырька была ограничена скоро -стью звука в воде, так как модель некорректно описывает процессы, происходящие при дальнейшем схлопывании кавитационного пузырька. Далее эту стадию схлопывания мы будем называть пр омежуточной: этой стадии предшествует образование пузырька, его расширение и начало схлопывания.
Явления, происходящие на конечной стадии схлопывания, котор ые в данной работе не рассматривались, имеют ха рактер ные времена порядка наносекунд и связаны с катастрофическим ростом температуры и давления внутри пузырька. На этой стадии схлопывания важную роль играет упругость пара, заключенного в пузырьке, и явления теплопер ено са. С конечной стадией схлопывания кавитационного пузырька связаны химические и оптические эффекты кавитации, образование ударных волн, а также микроструй, вызванных отклонением пузырька от сферической фор мы [8].
МОДЕЛИРОВАНИЕ ДИНАМИКИ РАС ТЯЖЕНИЯ Ф РАГМЕНТА ДНК
Для исследования динамики р астяжения фрагмент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.