ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2014, том 56, № 2, с. 188-192
МЕДИЦИНСКИЕ = ПОЛИМЕРЫ
УДК 541/(64+18)
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРЫ ДЛЯ КОНТАКТА С КРОВЬЮ1
© 2014 г. И. Л. Валуев, Л. В. Ванчугова, И. В. Обыденнова, Л. И. Валуев
Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук 119991 Москва, Ленинский пр., 29 Поступила в редакцию 22.05 2013 г. Принята в печать 19.11.2013 г.
Привитой сополимеризацией на поверхность синтетического полимера (полиэтилена, поли-этилентерефталата, полидиметилсилоксана) смеси гидрофильного мономера и макромономеров гирудина и овомукоида, синтезированы новые материалы, предназначенные для контакта с кровью. Показано, что модификация поверхности полимера прививкой только гидрофильного мономера приводит к уменьшению степени денатурации адсорбированных белков, а введение в гидрофильный слой гирудина и овомукоида обеспечивает понижение количества адгезиро-ванных поверхностью полимера тромбоцитов и увеличение времени свертывания крови на полимерной поверхности.
DOI: 10.7868/S2308113914020168
Все применяемые в настоящее время в контакте с кровью материалы, предназначенные для изготовления магистралей аппаратов искусственного кровообращения и деталей имплантируемых в живой организм искусственных органов, по своей гемосовместимости весьма далеки от природных материалов. И это естественно, поскольку контакт крови с любым чужеродным материалом, включая полимеры, в силу естественной защитной реакции организма должен приводить к ее свертыванию. Положительные результаты имплантации некоторых полимерных материалов определяются либо относительно небольшими размерами имплантата (сердечные клапаны), либо тем, что в условиях интенсивного кровотока продукты тромбообразования постоянно смываются с поверхности полимера и гидролизуются фибринолитическими ферментами крови. В обоих случаях защитные системы организма в состоянии справиться с тромбоэмболией.
Процесс свертывания крови на поверхности полимеров включает в основном три этапа [1]: адсорбция белков с изменением их нативной кон-формации; адгезия и агрегация тромбоцитов, сопровождающиеся их разрушением и выделением
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 1208-00123) и Программ Отделения химии и наук о материалах РАН № 3 и 7, а также Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки — медицине".
E-mail: ivaluev@ips.ac.ru (Валуев Иван Львович).
веществ, вызывающих дальнейшую агрегацию тромбоцитов; активация факторов свертывания крови с образованием тромбина, катализирующего превращение растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, который вместе с застрявшими в нем форменными элементами крови и представляет тромб.
Исходя из этого механизма, наиболее распространенным подходом к повышению тромборе-зистентности полимеров является их модификация биологически активными соединениями, ин-гибирующими ту или иную стадию процесса тромбообразования [2]. Наибольшее распространение в качестве такого соединения получил природный антикоагулянт крови — гепарин. Механизм его действия заключается в нейтрализации свертывающей активности тромбина путем ускорения его реакции с антитромбином III [3].
Впервые для повышения тромборезистентно-сти полимерных материалов гепарин был использован еще в 1963 г. [4] и с тех пор он остается практически единственным модификатором полимеров, нашедшим применение в клинике.
Обычно модификации подвергают поверхность уже готового полимерного изделия, поскольку если модифицировать исходное сырье, в процессе его переработки в изделие происходит разрушение модифицирующего агента с потерей им биологической активности. К принципиальным недостатком такого подхода относится и то, что в процессе эксплуатации иммобилизованные
на поверхности изделия вещества инактивируют-ся присутствующими в крови биологически активными соединениями. Например, в плазме крови человека присутствуют более 20 различных белков, способных нейтрализовать антикоагу-лянтную активность гепарина [2].
В связи с этим пристального внимания заслуживает гирудин — полипептид, выделяемый из слюнных желез медицинских пиявок или получаемый рекомбинантным способом; гирудин состоит из 65 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 12000. Основная биологическая функция гирудина заключается в предотвращении свертывания крови за счет нейтрализации активности тромбина путем образования комплекса тромбин—гирудин [5]. Гирудин является антикоагулянтом прямого действия. В отличие от гепарина он не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. В связи с этим в последние годы гирудин получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, когда гепаринотера-пия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д.
Известны работы, в которых гирудин был использован для модификации полимеров с целью повышения их тромборезистентности. Его иммобилизовали на полиэфирах [6, 7], полиуретанах [8], полиэтилене [9], сополимерах лактид-глико-лид [10]. В указанных работах отмечено, что в результате иммобилизации активность гирудина существенно понижается, что, вероятно, связано с его частичной инактивацией на твердой, гидрофобной поверхности полимера. Действительно, используя предложенный нами подход [11], заключающийся в предварительной гидрофилиза-ции поверхности полимера с последующей иммобилизацией биологически активного вещества в гидрофильном слое, в работе [12] удалось синтезировать модифицированный политетрафторэтилен с относительно высокой антикоагулянт-ной активностью гирудина.
Поскольку в природных кровеносных сосудах жидкое состояние крови поддерживается комплексом биологически активных веществ, одновременно воздействующих на все стадии каскадного процесса тромбообразования [13], представлялось естественным расширить ассортимент тромборезистентных полимеров путем совместной иммобилизации антикоагулянта и соединения, препятствующего адсорбции тромбоцитов. В связи с этим цель настоящей работы заключает-
ся в модификации поверхности полимерных материалов гирудином и овомукоидом— гликопро-теином с М = 31000, который является ингибитором протеолитических ферментов и обладает антиагрегирующим действием по отношению к тромбоцитам [14, 15].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали генноинженерный гирудин ("Sigma", США), овомукоид из белка утиных яиц ("Белмедпрепараты", Беларусь), акрила-мид ("Aldrich", США), N-винилпирролидон ("Al-drich", США), а также промышленно выпускаемые полиэтилен, полиэтилентерефталат и полидиметилсилоксан.
Макромономер овомукоида получали ацили-рованием овомукоида хлорангидридом акриловой кислоты. Для этого 1.0 г овомукоида растворяли в 100 мл бикарбонатного буфера при рН 8.0 к раствору при 4°C и перемешивании добавляли 0.1 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Перемешивание продолжали 30 мин. Аналогично получали макромономер гирудина.
Для проведения привитой сополимеризации в ампулу загружали пленку полимера толщиной 0.1 мм с площадью поверхности 10 см2 и 10 мл водного раствора, содержащего 0.4 г акриламида или N-винилпирролидона, 0.05—0.10 г макромономера гирудина и 0.05—0.10 г макромономера овомукоида. Ампулу вакуумировали до 10-3 мм рт.ст., запаивали и облучали 60Со при комнатной температуре, мощности дозы 0.4 Мрад/ч в течение 10 ч. Ампулу вскрывали, полимер промывали водой и физиологическим раствором (0.9%-ный раствор NaCl. Степень вхождения макромономеров в состав привитого слоя, оцененная по количеству не вступивших в реакцию соединений, при указанных условиях облучения составляла 33— 40%.
Тромборезистентность полимера оценивали по общепринятым методикам: измеряли время свертывания крови на поверхности полимера, определяя количество адгезированных тромбоцитов и оценивали константу скорости активации системы комплимента — показатель степени денатурации белков в результате взаимодействия с полимером [2].
В первом методе на поверхность полимера наносили каплю крови человека и измеряли время образования сгустка. Оценку адгезии тромбоцитов проводили с использованием метода электронной микроскопии. На поверхность полимера наносили каплю (~50 мкл) богатой тромбоцитами плазмы крови человека. Полимер и плазму вы-
190 ВАЛУЕВ и др.
Влияние модификаторов на тромборезистентность полимерной поверхности
Количество макромономера Гидрофильный к х 106, (±10%) с 1 см 2 ОПАТ ОВС
гирудин овомукоид мономер (± 6%) (±5%)
Поверхность полиэтилена
Нет Нет Нет 4.6 1.8 1.6
Нет Нет Акриламид 2.4 1.4 2.2
0.10 0.10 Нет 4.5 1.7 2.0
0.05 Нет Акриламид 1.9 1.5 4.2
0.10 Нет » 2.6 1.4 5.0
Нет 0.05 » 2.3 0.9 2.2
Нет 0.10 » 2.1 0.7 2.6
0.05 0.10 » 2.5 0.6 8.0
0.10 0.10 » 2.8 0.7 11.0
0.10 0.05 » 2.8 0.6 10.0
0.05 0.05 » 2.4 0.5 9.0
0.05 0.05 М-винилпирролидон 2.9 0.6 9.0
0.10 0.10 » 3.2 0.3 11.0
Поверхность полиэтилентерефталата
Нет Нет Нет 4.1 1.4 1.5
0.10 0.10 Акриламид 2.9 0.5 11.0
Поверхность полидиметилсилоксана
Нет Нет Нет 3.2 1.0 1.6
0.10 0.10 Акриламид 2.3 0.4 11.0
держивали при 20°С в течение 15 мин. Затем полимер промывали 0.9%-ным раствором №С1 для удаления неадгезированных тромбоцитов и белков. Полимер обрабатывали 2.5%-ным раствором глутарового альдегида в течение 1 ч и промывали последовательно водой, 20, 70, 90 и 100%-ным этанолом. Пленку высушивали и напыляли медью. На поверхности выбирали 20 полей размером 28 х 28 мкм, на которых измеряли количество тромбоцитов.
Сравнительным материалом в обоих методах служило стекло. Определяли относительное время свертывания крови (ОВС) — время свертывания крови на поверхности полимера, деленное на время свертывания крови на поверхности стекла, и относительный показатель адгезии тромбоцитов (ОПАТ) — количество тромбоцитов на поверхности полимера, деленное на количество тромбоцитов на поверхности стекла.
Для оценки константы скорости активации системы комплемента к свежую человеческую
сыв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.