БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 10, с. 1338 - 1346
УДК 612.115.12
МОДУЛЯЦИЯ ТРОМБИНОМ И ФАКТОРОМ Xa ВЫЖИВАЕМОСТИ ГИППОКАМПАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ***
© 2006 г. Л.Р. Горбачева1, Т.П. Сторожевых2, В.Г. Пинелис2, С. Ишивата3, С.М. Струкова1***
1 Кафедра физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова,
119899 Москва; электронная почта: strukova@mail.ru
2 Лаборатория мембранологии ГУ Научного центра здоровья детей РАМН, 119991 Москва
3 Department of Physics, Faculty of Science and Engineering, Advanced Research Institute for Science and Engineering, Waseda University, Tokyo, Japan
Поступила в редакцию 28.04.06 После доработки 08.06.06
Исследовано влияние тромбина, фактора Xa (FXa) свертывания крови и пептидов-агонистов рецепторов 1 и 2, активируемых протеиназами (PAR1-AP и PAR2-AP), на выживаемость культивируемых гиппокампаль-ных нейронов крысы и внутриклеточный кальциевый гомеостаз при глутаматной цитотоксичности. Тромбин и FXa в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 нМ существенно снижали гибель нейронов после действия глутамата. Инактивация ферментов отменяла их протекторное действие. С помощью агонистов (PAR1-AP и PAR2-AP) и антагониста PAR1 показано, что нейропротекторное действие тромбина на нейроны реализуется через активацию PAR1, а FXa — через новый подтип рецепторов PAR. Установлено, что тромбин, в отличие от FХа, вызывает в гиппокампальных нейронах транзиторный кальциевый ответ, который опосредуется, главным образом, ^-рецепторами эндоплазматического ретикулума. Обе сериновые протеиназы стимулируют восстановление кальциевого гомеостаза гиппокампальных нейронов в постглутаматный период.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: тромбин, фактор Ха, глутаматная токсичность, апоптоз, внутриклеточный кальций, гиппокампальные нейроны.
Тромбин (КФ 3.4.21.5) — узкоспецифичная сериновая протеиназа семейства трипсина — ключевой фермент свертывающей системы крови, образуется в результате ограниченного про-теолиза протромбина фактором Ха свертывания крови в участках повреждения сосудов и ткани. Тромбин участвует в регуляции многих физиологических и патофизиологических процессов, взаимодействуя с рецепторами, активируемыми протеиназами (PAR1, PAR3 и PAR4) [1-3]. Тромбин активирует реакции положительной и
Принятые сокращения: FXa — активированный фактор X свертывания крови; PAR — рецептор, активируемый протеиназой; PAR1-AP — пептид-агонист рецептора 1, активируемого протеиназой; ABE1 — анионсвязывающий экзосайт 1; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; 2-APB — 2-амино-этоксидифенилборат; PMSF — фенилметилсульфонил фторид; AraC — арабинозид цитозина.
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-117, 13.08.06.
*** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
отрицательной обратной связи в системе гемостаза и фибринолиза, участвует в регуляции сосудистого тонуса, развития организма, а также процессов воспаления, репарации тканей, ате-рогенеза, канцерогенеза и нейродегенератив-ных заболеваний (болезнь Альцгеймера и др.) [2—6]. Особенностью структуры тромбина является наличие кроме классического активного центра двух субцентров, называемых анионсвя-зывающими экзосайтами (ABE) [6, 7]. Обладая высокой избирательностью в узнавании комплементарных доменов рецепторов (PAR1, тром-бомодулина), субстратов и ингибиторов (ABE1), связывании с гликозаминогликанами (ABE2) [8], они обеспечивают мультифункциональ-ность тромбина в реакциях воспаления и репарации тканей, всегда сопровождающихся активацией системы свертывания и накоплением тромбина в участке повреждения сосуда и прилежащей ткани [4, 7, 9, 10]. Полученные к настоящему времени данные о роли тромбина в травматическом и ишемическом повреждении мозга противоречивы. Тромбин рассматривают
как фактор гибели, так и выживания нервных клеток [10—17]. Показано, что введение тромбина в хвостатое ядро вызывает развитие воспаления и отека, а низкие концентрации фермента оказывают защитное действие на клетки ЦНС [13, 16]. Кратковременные ишемические эпизоды в нервной системе приводят к развитию устойчивости к последующей тяжелой ишемии мозга и в этот феномен, по-видимому, вовлекается тромбин [16]. Функции фактора Ха (FXa) свертывания крови, сериновой протеиназы, которая может активировать PAR1, но преимущественно активирует PAR2 [3, 6], вне гемостаза и воспаления малоизвестны. Обнаружена экспрессия мРНК протромбина, FXa, а также рецепторов PAR в областях мозга, наиболее уязвимых для ишемического повреждения, среди них — кора, стриатум, гипоталамус, гиппокамп и мозжечок [13, 17—19]. Данные о роли PAR в регуляции выживаемости клеток также противоречивы. Обнаружена нейродегенеративная функция PAR2-рецепторов [20], в то же время при повреждении, нейровоспалении и ишемии снижается гибель клеток при активации этих рецепторов [21—24]. Ряд авторов указывают на усиление повреждения мозга при активации PAR1-рецеп-торов в условиях ишемии/гипоксии [24]. Известно, что такие повреждения мозговой ткани как травма, ишемия, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера и т.п.) связаны с гиперстимуляцией глутаматных рецепторов [25]. Массивный вход Са2+ по каналам ионо-тропных глутаматных рецепторов в нервные клетки нарушает гомеостаз этого внутриклеточного мессенджера, что ведет к запуску сложного процесса апоптотической гибели клеток [26, 27]. Поэтому изучение реакций, запускаемых в нервных клетках сериновыми протеиназами, при глутаматной токсичности представляет особый интерес. Целью нашей работы было исследование влияния тромбина и FXa на выживаемость и кальциевый гомеостаз культивируемых гиппокампальных нейронов крыс в условиях глутаматной токсичности.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение культуры гиппокампальных нейронов. Исследования проводили на 9-14-дневной первичной культуре нейронов гиппокампа, извлеченного из мозга одно-трехдневных крысят линии Вистар. Суспензию клеток получали по ранее описанному методу [28] и переносили на покровные стекла, покрытые поли^-лизином (10 мг/мл). Клеткам давали сесть на стекло в течение 1 ч при 37°, 5% СО2, затем отбирали не-
прикрепившиеся клетки и добавляли 1,5 мл культуральной среды (нейробазальная среда — А, содержащая 2% Supplement B-27 и 0,5 мМ L-глютамина). На 3—4 день на сутки добавляли арабинозид цитозина (AraC, 10-5 М) для подавления роста глиальных клеток.
Оценка гибели нейронов. Гибель нейронов в культуре определяли через сутки после 15-минутного действия глутамата и исследуемых веществ, которые добавляли к клеткам, сменив временно культуральную среду на Hepes-соле-вой буфер (HBSS). Состав HBSS в мМ: NaCl -145, KCl - 5, CaCl2 - 1,8, MgCl2 - 1,0, Hepes -20, глюкоза - 5 (рН 7,4). Гибель оценивали двумя способами: биохимическим, основанным на измерении выхода цитоплазматической лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) в среду, и морфологическим. Активность ЛДГ определяли фотометрически на микропланшетном ридере Аnthos Lucy1 («Anthos Labtec Instruments», Австрия) с помощью LDH-L реагента (набор фирмы «Diagnostic Chemicals Limited», Канада). Процент гибели нейронов рассчитывали как отношение активности ЛДГ в клеточной среде к активности ЛДГ после лизиса клеток 0,2% Triton Х-100 в течение 15 мин при 37° в процентах.
Морфологическая оценка гибели нейронов (апоптоз) включала исследование ядерной фрагментации с помощью флуоресцентного ДНК-тропного красителя Hoechst 33342 (абсорбция 360 нм, эмиссия 460 нм), который свободно проникает в живые клетки и присоединяется к А-G-парам в местах разрывов в цепи ДНКс поврежденной, фрагментарной ДНК [29]. Окрашенные клетки исследовали и подсчитывали под флуоресцентным микроскопом (Axiovert 200 «Zeiss», Германия) визуально и количество апоптотических клеток выражали в процентах.
Регистрация внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]j). [Ca2+]j измеряли с помощью флуоресцентных зондов Fura-2/AM или Fura-2РБ/АМ с высоким и низким сродством к Ca2+ соответственно. Спектр возбуждения флуоресценции этих липофильных зондов смещается к более коротким волнам при связывании зонда с Са2+. До начала опытов клетки загружали зондом (5 мкМ) в течение 40 мин в культуральной среде, затем культуры отмывали HBSS. Стекло с клетками помещали в перфузионную камеру (0,2 мл), смонтированную на столике инвертированного микроскопа Axiovert 200. Флуоресценцию возбуждали поочередным освещением по 100-200 мс при 340 и 380 нм, эмиссию измеряли при 505 ± 10 нм. Встроенная видеокамера («Roper Scientific», США) и компьютерная программа Metafluor 6.1 («Universal Imaging Corp.», США) позволяли получать цифровую запись
эксперимента и ее обрабатывать. В опытах, в которых использовали Fura-2FF/AM, изменения [Ca2+]i оценивали по отношению флуоресценции F340/F380. В остальных опытах определяли абсолютные значения [Ca2+]i [30]. Во всех опытах из регистрируемой от нейронов флуоресценции вычитали фоновую флуоресценцию. Все опыты проводили при комнатной температуре (26°).
Материалы. Тромбин быка, FXa быка, флуоресцентный краситель Hoechst 33342, NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, KH2PO4, HEPES, глюкоза, ЭГТА, 2-APB, дантролен, иономицин, тетродо-токсин, глутамат, NMDA, PMSF, glutamax, AraC, TritonX-100, поли-D-лизин («Sigma», США); Fura-2/AM, Fura-2FF/AM («Molecular Probes», США); синтетические пептиды-агонисты PAR1 (PAR1-AP, TFLLRN) и PAR2 (PAR2-AP, SLI-GRL) («Biosyntan», Германия) и антагонист PAR1, Mpr(Cha) (Mercaptopropionyl-F (Cha-Cha)RKPNDK-NH2) любезно предоставлен A. Кавабата; нейробазальная среда — А («Gibco», США), содержащая 2% Supplement B-27 и L-глутамин («Gibco»); LDH-L реагент («Diagnostic Chemicals Limited»).
Статистическую обработку данных проводили в парных выборках, используя t-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние тромбина и FXa на гибель гиппокампальных нейронов при глутаматной токсичности.
В первой серии экспериментов исследовали гибель (некроз) культивируемых гиппокампаль-ных нейронов крыс биохимическим методом через 24 ч после 15-минутного действия 100 мкМ глутамата или совместного действия глутамата с тромбином, синтетическим пептидом — агон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.