ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2007, том 54, № 4, с. 584-589
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА GmAMS1, КОДИРУЮЩЕГО Р-АМИРИНСИНТАЗУ СОИ
© 2007 г. Е. Чанг*, Ч. В. Чо*, К. Й. Ким*, Ж. Чанг**, Ж. И. Ким***, Й. С. Чанг*, К. Фукуи****, Ж. Х. Ли*
* Кафедра генной инженерии, Университет Донг-А, Бузан, Корея ** Кафедра агрономии, Гионгсангский государственный университет, Джинъю, Корея *** Институт продоволъствия и естественных наук, Исследователъский центр здорового питания,
Инжский университет, Кимхае, Корея **** Кафедра биотехнологии, Университет Осаки, Суита, Осака, Япония Поступила в редакцию 01.11.2006 г.
Для выделения из растений сои (Glycine max (L.) Merr.) фрагментов кДНК, синтез которых был индуцирован поранением, применяли метод супрессивной вычитающей гибридизации. Один из фрагментов кДНК, gmwi33, обозначенный нами как GmAMSl, оказался гомологичным генам, кодирующим Р-амиринсинтазу. Белок GmAMSl оказался на 89% идентичным белку GgbASl из солодки. Сильным индуктором экспрессии гена GmAMSl в пятидневных выращенных в темноте проростках сои являлся свет, слабыми индукторами - метилжасмонат и низкая температура. Элиситор из экстракта дрожжей или УФ-В не индуцировали экспрессию этого гена. Гибридизация геномной ДНК и флюоресцентная гибридизация in situ показали, что геном сои содержит две копии гена GmAMSl. Насколько нам известно, это первая публикация о в-амиринсинтазе из сои.
Glycine max - поранение - стресс - FISH
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в сое содержится много полезных для здоровья веществ, таких как изофлаво-ноиды, фитиновая кислота, сапонины, ингибиторы протеаз, растительные стерины и фенольные вещества. Ранее было показано, что сапонины обладают многими фармакодинамическими свойствами: антиоксидантными [1], антивирусными [2, 3], антигепатотоксическими [4] и противоопухолевыми [5]. Однако молекулярная и физиологическая роль сапонинов сои мало изучена.
Сапонины сои делятся на три группы (А, В и Е) в зависимости от строения их агликонов [6]. Они имеют общее промежуточное соединение биосинтеза, в-амирин, синтезируемое в-амиринсин-тазой, или оксидоскваленциклазой (ОСЦ). ОСЦ катализирует циклизацию 2,3-оксидосквалена, который является промежуточным соединением
Сокращения: Мж - метилжасмонат; ОСЦ - оксидосквален-циклаза; ПЦР - полимеразная цепная реакция; FISH - флюоресцентная гибридизация in situ (от Fluorescence In Situ Hybridization); RACE - быстрая амплификация концов кДНК (от Rapid Amplification of cDNA Ends); SSH - супрессивная вычитающая гибридизация (от Suppression Subtractive Hybridization).
Адрес для корреспонденции: J.-H. Lee. Department of Genetic Engineering, Dong-A University, Busan, 6047-14 Republic of Korea. Fax: 82-051-200-7505; e-mail: jhnlee@dau.ac.kr
биосинтеза как тритерпенов, так и фитостеринов [7, 8].
Клонировано четыре типа кДНК в-амирин-синтазы: из Panax ginseng [9, 10], Pisum savitum [11], Glycyrrhiza glabra [9] и Euphorbia tirucalli [12]. Ранее сообщалось о генах других ОСЦ, таких как лупеолсинтаза [13], циклоартенолсинтаза [9, 11], ланостеринсинтаза [14-16]. Кроме того, были охарактеризованы смешанные функции тритер-пенсинтаз из гороха [17], A. thaliana [18] и Luffa cylindrical [19]. Они участвуют в синтезе а- и 0-ами-рина или данных тритерпенов и лупеола.
В настоящей работе мы выделили ген GmAMSl, кодирующий в-амиринсинтазу сои, используя метод супрессивной вычитающей гибридизации (SSH от Suppression Subtractive Hybridization). Сильным индуктором экспрессии гена GmAMSl оказался свет. Низкая температура и поранение также индуцировали экспрессию фермента. Анализ с помощью методов гибридизации геномной ДНК и флюоресцентной гибридизации in situ (FlSH от Fluorescence In Situ Hybridization) показал, что геном сои содержит две копии гена GmAMSl.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия выращивания. Семена сои (Glycine max (L.) Merr., сорт Sin-
paldal 2) проращивали в специальной камере при 25°С с фотопериодом 16 ч при освещенности 22 клк. Через 3 нед. молодые листья собирали для выделения суммарной РНК. Для исследования методом SSH выросшие листья трехнедельных растений ранили прокалыванием 2-4 отверстий. Пораненные листья собирали через 3, 6, 12 и 24 ч для выделения суммарной РНК. Растительные препараты немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -75°С вплоть до выделения РНК.
Супрессивная вычитающая гибридизация. SSH
выполняли, используя набор PCR-Select cDNA Subtraction ("Clontech", США) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК, синтезированную на основе мРНК, выделенной из здоровых листьев, использовали в качестве драйвера. Тестер готовили из кДНК, синтезированной на основе мРНК, выделенной из пораненных листьев. Синтез первой и второй цепи кДНК, а также тупых концов ДНК проводили в соответствии с инструкциями производителя ("Clontech"). Продукты второй полимеразной цепной реакции (ПЦР) встраивали в вектор pCR2.1, используя набор TA Cloning Kit ("Invitrogen", США). После отбора по-зитивнных клонов проводили секвенирование ДНК ("Genotech", Корея), и полученные последовательности анализировали с помощью программы BLAST путем сравнения с генами из базы данных GenBank/E MBL.
Быстрая амплификация концов кДНК (RACE).
Полную последовательность кДНК гена GmAMSl выделяли с помощью набора SMART RACE (от Rapid Amplification of cDNA Ends, "Clontech"). Этот набор включает реактивы для синтеза двух отдельных видов кДНК: 5'-RACE-Ready кДНК и 3'-RACE-Ready кДНК. Для амплификации с помощью ПЦР использовали следующие ген-специфические праймеры: 5'-CTGTCACAAAGAAG-GCATGGAAACC-3' для 5'-RACE и 5'-GGAC-TAATTCATGCTGGACAGGCGG-3' для 3 '-RACE. Программа RACE-ПЦР состояла из 20 циклов со следующими параметрами шагов: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 68°С в течение 30 с, синтез при 72°С в течение 3 мин. Каждый продукт ПЦР клонировали с помощью набора Original TA Cloning Kit ("Invitrogen").
ДНК- и РНК-гибридизация. Суммарную РНК экстрагировали горячим фенолом, используя модифицированный метод [20]. Для нозерн-гибри-дизации 20 мкг суммарной РНК разделяли в 1%-ном агарозо-формальдегидном геле [21]. Пробы метили с помощью 32Р-дЦТФ с использованием набора Ladderman™ ("Takara", Япония). Предварительную гибридизацию, гибридизацию и отмывку проводили, как описано Church и Gilbert [22].
Для блот-анализа геномной ДНК ее выделяли из листьев сои, как описано Shure с соавт. [23]. ДНК подвергали гидролизу с помощью фермен-
тов EcoRI, HindlII или XbaI, и продукты разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Мечение зондов, предварительную гибридизацию, гибридизацию и отмывку проводили в соответствии с инструкцией DIG manufacture ("Roche", Германия). Гибридизацию регистрировали с помощью anti-digoxigenin-AP, а затем визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата CSPD. Последующие операции по отмывке мембранного фильтра и экспозиции с рентгеновской пленкой проводили, согласно обычной процедуре нозерн-гибридизации.
Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). Для исследования методом FISH соевые бобы проращивали, как описано в [24]. Распластывание хромосом осуществляли методом ферментативной мацерации и воздушной сушки с некоторыми изменениями. Сигнал регистрировали с помощью красителей anti-dig родамин и anti-sheep техасский красный. Предметные стекла окрашивали с помощью YOYO-1 и наблюдали с помощью флюоресцентного микроскопа Axioplan ("Carl Zeiss", Германия). Изображения фотографировали и анализировали с помощью компьютерных программ Adobe Photoshop 7.0 и IPLab Spectrum.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Метод SSH применяли для выделения генов, избирательно экспрессирующихся в ответ на поранение и обработку элиситором из грибов. Оказалось, что кДНК гена GmAMSl, экспрессию которого индуцировало поранение, имеет высокую степень гомологии с геном GgbAS1, кодирующим ß-амиринсинтазу G. glabra (89%) (рис. 1). Ген GmAMS1 имеет длину 2416 п.н. и соответствует белку из 739 аминокислотных остатков с предсказанной мол. м. 84 к Д. Выведенная на основании нуклеотидной последовательности гена GmAMS1 аминокислотная последовательность белка GmAMSl имеет высокую степень гомологии с ß-амиринсинтазой других растений (рис. 1). Полученная аминокислотная последовательность имеет наиболее высокую степень гомологии (89%) с белком GgbASl из G. glabra (AB037203). Выявлена также ее гомология на 86% с OSCPSY из гороха (AB034802), а также на 76% и 74% с OSCPNY1 (AB009030) и OSCPNY2 (AB014057) из P. ginseng соответственно.
Полученная аминокислотная последовательность белка GmAMSl и мела также сходство с другими ОСЦ и содержала консервативный фрагмент DCTAE, участвующий в связывании субстрата, и 4 консервативных фрагмента QW -высоко консервативные области с повторяющимися участками ß-структуры [25] (помещенный в рамку участок на рис. 1). Фрагмент QW может участвовать в стабилизации карбокатионных промежуточных соединений в реакции циклиза-
GmAMSl G g b AS 1 OSCPSY OSCPNY1 OSCPNY2
GmAMSl
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMSl
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
GmAMS1
GgbAS1
OSCPSY
OSCPNY1
OSCPNY2
MWRLKIADGG-NDPYI FSTNNFVGRQTWEFDPEAG-SPEERAQVEAARQHFYHNRFKVKPCADLLWRFQVLRENNFKQTIPRVT -
. E. .-K. . . .Y............Y. . DG.-T
. E. ...... L.............Y.....-E.
. E. NK. . . . LY...............DYVA. .
. K. ...... LY.....I.........DY. -T .
D...L...N. . E . . RN . . . N . LEE. .QV. RQ.WD. . .E. .E. . L. .WN.
Q. .E. YQ . YQ .
.G. .G. . SG . . SS .
. . K. K. K.
. AS . K . . GG . K . . .Q. K I . .Q. K
IEDGEEITYQKVTSAVRRGAHHLAALQTSDGHWPAQIAGPLFFLPPLVFCMYITGNLESVFPEEHRKEILRYTYYHQNEDGGWG .G.......E.A.T.
E.....E.T.TTL.
VG.D.AV..EAA.TTL. V........EAA.TTL.
. . T . . . . T . .AV.FFS.. .AV.YFS..
A. . AD .
.........M......V....H.D....P.
.ENS..........M.V. . . . H.DT. . . A.
. EN ........... M . L . . . . H . NT
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.