ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 6, с. 629-637
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.17:595.773.4
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА Lim3, РЕГУЛИРУЮЩЕГО РАЗВИТИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, В ГЕОГРАФИЧЕСКИ ОТДАЛЕННЫХ
ПОПУЛЯЦИЯХ Drosophila melanogaster
© 2014 г. Е. Р. Веселкина, О. Ю. Рыбина, А. В. Симоненко, В. Е. Алаторцев,
Н. В. Рощина, Е. Г. Пасюкова
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182
e-mail: egpas@rambler.ru Поступила в редакцию 12.11.2013 г.
Проведено сравнение изменчивости регуляторной области гена Lim3, играющего ключевую роль в развитии нервной системы, в двух популяциях Drosophila melanogaster (Александров, Россия и Raleigh, США), обитающих в различных экологических условиях и географических районах. Сравнение последовательностей нуклеотидов 16 и 20 аллелей из популяции Александров 2010 г. и 2011 г., соответственно, показало, что в обоих случаях уровень изменчивости нетранслируемой области гена существенно ниже уровня изменчивости 5' регуляторной области, прилегающей к старту транскрипции. По качественным и количественным показателям изменчивости заметных различий между выборками разных лет не выявлено, что указывает на стабильность существования популяции на северной границе ареала вида. Паттерн полиморфных сайтов сходен в двух популяциях, что может свидетельствовать как о нейтральности выявленной изменчивости в отношении экологических факторов, так и о важной роли замен нуклеотидов в определенных сайтах регуляторной области в контроле экспрессии гена.
DOI: 10.7868/S0016675814050117
Анализ генетической изменчивости в природных популяциях является важной задачей попу-ляционной генетики, а Drosophila melanogaster — традиционным объектом таких исследований. В течение последних лет было собрано достаточно много информации об исходном и наиболее информативном уровне изменчивости — уровне последовательностей ДНК различных функционально важных генов дрозофилы (например, [1— 5]). Новый этап исследований в этой области был связан с анализом изменчивости на уровне не отдельных генов, а целых геномов [6—8]. В связи с развитием методической базы популяционно-ге-нетических исследований особую актуальность приобретают несколько задач. Во-первых, важно понять, каково функциональное значение существующей в природе структурной изменчивости генома. Исследование этого вопроса поможет пролить свет не только на механизмы поддержания генетической изменчивости в природе, но и на механизмы, регулирующие работу генов и генома в целом. Во-вторых, представляет интерес изучение последовательностей отдельных генов и геномов в популяциях, обитающих в различных экологических условиях и географических районах. Работа в этом направлении уже начата (например, [9, 10] — анализ отдельных генов; [11, 12] — полногеномный анализ). Выявление ассоциаций между молекулярным полиморфизмом и услови-
ями среды — в настоящее время наиболее перспективное направление популяционной, эволюционной и экологической генетики. Наконец, остается невыясненным вопрос о том, как меняется паттерн изменчивости в одной и той же популяции с течением времени. Нельзя исключить, что разница в значении параметров, характеризующих изменчивость географически и экологически отдаленных популяций, определяется на самом деле тем, что материал для исследования был собран в разные годы (см., например, [7]).
Особый интерес для изучения адаптации организмов представляют гены, участвующие в развитии и функционировании нервной системы, которая обеспечивает взаимосвязанную регуляцию деятельности всех систем организма, реакцию на изменение условий внутренней и внешней среды и сохранение гомеостаза. В течение ряда лет мы проводим всестороннее исследование роли генов, участвующих в формировании и функционировании нервной системы, в контроле продолжительности жизни. Для изучения природной изменчивости мы выбрали регуляторную область гена Lim3 (Lhx3/Lhx4), который играет ключевую роль в развитии нервной системы и специализации нейронов дрозофилы [13], птиц [14] и млекопитающих [15]. Проведенное нами исследование последовательности нуклеотидов регуляторной области гена Lim3 в популяции Raleigh (США)
показало, что структурная изменчивость этой области ассоциирована с шестикратным изменением количества транскрипта и изменением продолжительности жизни мух на 25%, причем комбинация нуклеотидов, ассоциированная с промежуточным уровнем экспрессии и высокой продолжительностью жизни, встречается в популяции с высокой частотой и, видимо, имеет селективное преимущество [4, 5]. Полученный результат иллюстрирует перспективность исследования популяционной изменчивости для выяснения механизмов, регулирующих работу генов и определяющих жизненно важные признаки.
В настоящей работе представлены результаты исследования полиморфизма регуляторной последовательности гена Lim3 у мух из природной популяции Александров (Россия), географически удаленной от ранее исследованной американской популяции. Две исследованные популяции обитают также в различных климатических условиях. Сравнение генетической изменчивости в двух популяциях позволяет говорить о существенном сходстве паттернов полиморфных сайтов, а также о сохранении его в течение нескольких лет.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии Drosophila melanogaster
Осенью 2010 и 2011 гг. в старом яблоневом саду на окраине города Александрова (Владимирская область, Россия) были отловлены самки дрозофилы, по фенотипическим признакам соответствующие описанию вида Drosophila melanogaster. От каждой самки была заложена линия. На основании фенотипа самцов в их потомстве, а также на основании результатов скрещивания этих самцов с самками стандартной линии D. melanogaster [16] была определена видовая принадлежность полученных линий. Линии вида D. melanogaster далее подвергали инбридингу, используя для получения следующего поколения одну оплодотворенную самку. После 20—25 поколений такого ведения полученные линии использовали для дальнейшей работы. Последовательности регуляторной области транскрипта Lim3A гена Lim3 были определены в 16 линиях 2010 г. и 20 линиях 2011 г.
Для сравнения использовали линии, полученные от индивидуальных самок, отловленных в 1999 и 2003 гг. на территории фермерского рынка в Raleigh (Рали, Северная Каролина, США) [2, 8]. Последовательности регуляторной области транскрипта Lim3A гена Lim3 в 50 линиях из коллекции 1999 г. были определены и проанализированы нами ранее [4, 5]. Последовательности нуклеоти-дов этого района в линиях из коллекции 2003 г. были извлечены нами из полногеномных последовательностей, представленных на http://mack-ay.gnets.ncsu.edu/MackaySite/DGRP.html [8], и
проанализированы в настоящей работе. Для анализа были отобраны линии, в которых в исследуемом участке ДНК все нуклеотиды были определены однозначно (61 линия: RAL 26, 28, 38, 41, 42, 57, 59, 69, 75, 101, 105, 138, 142, 149, 176, 181, 195, 208, 233, 239, 256, 280, 318, 320, 359, 362, 365, 367, 370, 371, 379, 383, 398, 437, 440, 492, 517,554,555, 642, 705, 716, 721, 727, 732, 737, 757, 761, 765, 799, 808, 810, 818, 820, 837, 859, 882, 884, 887, 890,892).
Выделение ДНК и подготовка проб для секвенирования
Выделение геномной ДНК проводили из 20 мух. К усыпленным диэтиловым эфиром мухам добавляли 500 мкл буфера TET следующего состава: 50 мМ Tris-HCl, 25 мМ EDTA, 0.2% Triton X-100, pH 8.0. Мух гомогенизировали, дебрис осаждали центрифугированием, к водной фазе добавляли 200 мкл TET, саркозилат натрия до 2% и протеи-назу K до 140 мг/мл и инкубировали 2 ч при 60°С. Затем проводили стандартную фенол-хлороформную экстракцию и осаждали ДНК, добавив NaCl до концентрации 100 мМ и 2.5 объема этанола. Осадок растворяли в 100 мкл бидистилли-рованной воды.
Для получения исследуемого фрагмента ДНК проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью амплификатора MJ MINI (BioRad). Для приготовления реакционной смеси использовали реактивы фирмы Sileks. Реакцию проводили в 1х PCR буфере c MgCl2 для HotTa^-поли-меразы с добавлением dNTPs до 0.2 мМ, праймеров до 0.2 мкМ, полимеразы HotTaq/Pfu (5 : 1) до 0.05 ед/мкл, 50 нг ДНК и бидистиллированной воды до 30 мкл. Праймеры были подобраны к регуляторной области гена Lim3: AGACGT-TGCTCTCGATCAGC и TCACATTTGCCATTG-GACAGGAAGTC. Секвенирование проводили на базе ЗАО "Евроген".
Обработка результатов
Уровень полиморфизма оценивали с помощью общепринятых показателей: п — наблюдаемая средняя доля нуклеотидных различий между се-квенированными аллелями и 0 — среднее число сегрегирующих нуклеотидов на сайт. В качестве теста на селективную нейтральность выявленного полиморфизма использовали показатель D Таджимы [17] и показатели D* и Ш* Фу и Ли [18]. Для вычисления этих показателей, а также для оценки параметров, характеризующих структуру гаплотипов (НГ) и неравновесие по сцеплению между выявленными полиморфными сайтами, использовали программу DnaSP 5.10.1 [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Drosophila melanogaster — космополитический синантропный вид, который встречается во всех зоогеографических зонах, причем холод является фактором, ограничивающим распространение данного вида [20]. Город Александров, расположенный на широте около 56° с.ш., находится на северной границе ареала Б. melanogaster, где выживание во время зимних холодов возможно в особых условиях, например в подвалах домов. Сравнительный анализ генетической изменчивости такой северной популяции представляет большой интерес.
Отлов мух в популяции Александров был проведен в октябре 2010 и 2011 гг. Мы секвенировали 16 (2010 г.) и 20 (2011 г.) вариантов 5' регуляторной области транскрипта ЫтЗЛ гена Ыт3 длиной 1117 пар нуклеотидов (пн), включая 827 пн собственно регуляторной области, предшествующей старту транскрипции, и 290 пн 5'нетранслируе-мой области (номера в GenBank ВапкШ670746 8ед1—8ед36 КР780879—КР780914). Выборка размером 15-20 аллелей, как было показано ранее [3], достаточна для получения адекватных показателей генетического разнообразия. Последовательность, прилегающая к старту транскрипции с 5'-конца, содержит 17 полиморфных сайтов в выборке аллелей 2010 г. и 19 полиморфных сайтов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.