ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 5, с. 714-717
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.21:598.112
МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ (ААТ)п-МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО ЛОКУСА Du47D ГЕНОМОВ ПАРТЕНОВИДА Darevskia unisexualis И ДВУПОЛЫХ РОДИТЕЛЬСКИХ ВИДОВ
D. valentini И D. raddei
© 2010 г. В. И. Корчагин, О. Н. Токарская
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: vitaly_korchagin@rambler.ru Поступила в редакцию 24.03.2009 г.
Микросателлитные повторы, являясь одним из наиболее распространенных элементов генома эу-кариот, мало изучены у видов с клональным типом размножения. С помощью ПЦР-анализа и се-квенирования ДНК изучена молекулярная структура аллельных вариантов тринуклеотидного мик-росателлитного локуса Du47D у партеновида Darevskia unisexualis и эволюционно-прародительских двуполых видов ящериц D. raddei и D. valentini рода Darevskia (Lacerta saxicola комплекс). Секвени-рование аллельных вариантов Du47D у D. unisexualis и аллелей ортологичного локуса у D. raddei и D. valentini показало, что все исследованные аллели характеризуются совершенной структурой мик-росателлитного кластера, отличаются количеством мономерных (ААТ)-звеньев и образуют определенные видоспецифические сочетания нуклеотидных замен, делеций и инсерций в прилежащих к микросателлиту последовательностях ДНК. Установлено, какие аллели Du47D партеновида унаследованы от D. valentini и какие — от D. raddei.
Популярность микросателлитов как универсально распространенных, эволюционно-кон-сервативных и одновременно генетически нестабильных ДНК постоянно растет в связи с многочисленными аспектами их применения. В то же время факторы, влияющие на структуру, генезис, геномную и/или хромосомную изменчивость микросателлитных локусов, остаются неясными, несмотря на интенсивные исследования последнего десятилетия [1]. Основная масса этих исследований относится к двуполым видам и только единичные — к однополым [2].
Облигатно-партеногенетические виды кавказских скальных ящериц рода Darevskia (ранее входивших в Lacerta saxicola комплекс [3]) представляют собой уникальную природную модель для изучения генетической изменчивости в популяциях, представленных исключительно самками. Парте-ногенетические ящерицы, имеющие диплоидный набор хромосом, произошли от эволюционно-прародительских "отцовских" и "материнских" видов того же рода путем межвидовой гибридизации [4]. Они характеризуются высоким уровнем гетерозиготности, незначительным полиморфизмом аллозимных локусов [5] и сайтов рестрикции мтДНК [6], а также относительно высокой изменчивостью ДНК-фингерпринтных спектров [7, 8]. В наших предыдущих работах были клонированы и охарактеризованы микросателлитные ди- и тетра-нуклеотидные локусы у ряда партеновидов (D. unisexualis, D. armeniaca, D. dahli и D. rostombekowi) ро-
да Darevskia и их двуполых прародительских видов (D. valentini, D. raddei, D. mixta и D. portschinskii) [9]. В настоящей работе впервые изучен полиморфный тринуклеотидный локус (ААТ)п-типа (Du47D, GenBank Ac. № FJ804739) у партеновида D. unisexualis и его родительских двуполых видов D. raddei и D. valentini.
В работе была использована полученная ранее геномная клонотека D. unisexualis [10]. Методом гибридизации колоний с использованием олиго-нуклеотидных зондов были отобраны и секвени-рованы рекомбинантные клоны, содержащие микросателлитные последовательности (ААТ)п. ДНК выделяли стандартным фенольно-хлоро-формным методом с использованием протеиназы К. Локус-специфическую амплификацию проводили с помощью праймеров D47F1: ACCTC-CTAATGATGTTTGACG и D47R3: TAAGCAGC-TATCCTATTTT в 20 мкл реакционной смеси (50 нг ДНК) с использованием Taq DNA Polymerase (Fermentas,) в ДНК-амплификаторе "MJ Mini" (Biorad) при следующих температурных режимах: денатурация при 94°С — 3 мин, амплификация в течение 30 циклов: 94°С — 1 мин, 50°С — 40 с, 72°С — 40 с, последний цикл — 5 мин при 72°С. Были проанализированы выборки D. unisexualis (N = 63), D. valentini (N = 19) и D. raddei (N = 39). Продукты амплификации фракционировали в 8%-ном на-тивном полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей визуализацией бромистым этидием. Ам-плификанты, различающиеся по электрофорети-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ
715
30 67 70
2 ... /.Т./.""- /..■■."".
а з ... ;'■.. .--.i. ■■■. ■ ■ ■■ ■.■■,■.
4 ____Ú. . ..Л^.ЛЧ - - - ¡AA'I ).
5
6
1 2
б 3 ____А____GG.TATAT (ААТ).
4
1 2
3
4
* 5 . ■ - - А____(j'i. TAT- ■ ¡AAT)..
6 7
134 143 175
.С____С____А.
.С____С----А.
, С____С.....А.
.С____С____А,
.С____С____А. .
.С____С____А.
201 234 255 .AG. .AG. .AG. .AG, .AG. .AG.
,T____A.
,T____A.
,T____A.
.T____A,
.T____A.
,T____A.
. . . .С. . . .с.. . . А....... .....AG. . . ,T. . . .A,,, .
... .с.. . .с.. . . А....... .....AG. . . .Т. . ..A.., .
. .т.. . с . , G . . 1 - .... AT.. .G . .T. .
... .т.. . .с.. . . G....... А .....AT. . . .G. . . .T____
....T.. . .c. . Л AT G ..T,...
____T. . . .c.. . .G....... -A ____AT. . . .G. . . ,T____
. . . ,T. . . .G............. .............AG. . . ,G. , .,T....
. . . ,T. . . .G............ .............AG. . . ,G. . . ,T... .
. . . ,T. . . .G............. .............AG. . . ,G. . .,T... .
. . . ,T. . . ,G............. .............GG. . . ,G. . ..T. . . .
____T. . . .G............. .............GG. . G ,.T____
Вариабельные участки аллелей локуса Ви47В у однополого и двуполых родительских видов рода Darevskia. а — "отцовский вид", D. \alentini; б — партеновид, D. ып^ехыаШ; в — "материнский вид", D. raddei. Цифрами обозначены положения нуклеотидных замен относительно самого протяженного аллельного варианта в, 7. Точками обозначены консервативные нуклеотидные области, дефис — единичные нуклеотидные делеции, А — область делеции 14 нуклеотидов.
ческой подвижности, элюировали из геля и секвенировали. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDye™ Terminator v.3.1. (GE Healthcare, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США). Последовательности выравнивали с использованием алгоритма Clustal W программы MEGA 4.0.
На рисунке представлены схематические изображения четырех аллельных вариантов Du47D партеновида D. unisexualis и аллелей орто-логичного локуса двуполых видов D. valentini и D. raddei. Были секвенированы 18 аллелей локуса Du47D D. unisexualis, причем оказалось, что два из них (варианты 2 и 3) являются мажорными, представлены во всех популяциях партеновида и встречаются с частотами 0.984 (2) и 0.95 (3) соответственно. Два других аллеля встречаются с частотами 0.016 (1) и 0.05 (4) и представлены в отдельных популяциях. Секвенированные аллели Du47D однополого вида характеризуются вариациями числа тринуклеотидных (AAT)-звеньев, многочисленными видоспецифическими нук-леотидными заменами, а также инсерциями и де-лециями во фланкирующих последовательностях ДНК на фиксированных расстояниях от микро-сателлитного кластера. Аллельные варианты Du47D двуполых видов (D. valentini и D. raddei) более полиморфны по сравнению с партенови-дом D. unisexualis. Они характеризуются большей
вариабельностью (ААТ)-звеньев микросателлит-ного кластера и более сложными преобразованиями нуклеотидных последовательностей, фланкирующих микросателлитный кластер, в том числе — делециями/инсерциями, видоспецифическими и единично-случайными нуклеотидными заменами. Наиболее разнообразны аллели Ви47Э D. raddei, популяции которого весьма гетероген-ны и недостаточно изучены.
Характерной особенностью аллелей Ви47Э D. ыnisexыalis является то, что два из них имеют видоспецифические точковые замены, инсерции и делеции, встречающиеся среди аллелей отцовского вида D. valentini (рисунок,а); другие два — среди аллелей материнского вида D. raddei (рисунок,»). Наблюдаемые нуклеотидные замены на флангах микросателлитного кластера образуют "отцовские" (А-(ТТ-)-С-А-О-Т-А) и "материнские" (О-(ТАТАТ)-Т-О-(-А—)-Т-С-Т) гаплоти-пы, определяющие структурные особенности аллелей дочернего партеновида (рисунок, б). Таким образом, в настоящей работе получена информация о молекулярной природе структурных вариаций и происхождении аллелей тринуклеотидного микросателлитного локуса Ви47Э партеногене-тического вида D. ыnisexыalis.
Известно, что микросателлитные повторы могут быть совершенными, состоящими из непрерывной последовательности мономорфных звеньев, несовершенными — в основной мотив встраиваются другие нуклеотиды и/или неполные звенья и сложными, когда микросателлит-ный кластер содержит более одного типа микро-
71б
КОРЧАГИН, ТОКАРСКАЯ
сателлита. По имеющимся данным, совершенные повторы микросателлитов более вариабельны, чем несовершенные. Согласно полученным данным, локус Du47D характеризуется совершенным микросателлитным повтором (AAT^-типа, поэтому многообразие аллельных вариантов Du47D как у партеновида, так и у двуполых видов объясняется отчасти вариациями самого микро-сателлитного кластера.
Считается, что основной процесс, приводящий к изменениям структуры микросателлитного кластера, происходит за счет ошибок репликации ДНК. Среди моделей, объясняющих мутации в микросателлитных локусах, наиболее распространена классическая одноступенчатая модель (stepwise mutation model, SMM), объясняющая возникновение мутаций в микросателлитном ло-кусе последовательно, на одно мономерное звено [11]. Модифицированный вариант этой модели предполагает изменение размера микросателлитного кластера более чем на одно мономерное звено (мультиступенчатый характер мутаций). В наших предыдущих работах по изучению мутаций в семьях партеновида D. unisexualis было показано, что мутации de novo у потомков происходят путем добавления или делеции одного мономерного звена, т.е. согласно классической модели [12]. Поэтому в случае локуса Du47D, содержащего совершенный микросателлит (AAT)n, можно предположить, что аллельные варианты партеновида произошли согласно классической модели "шаг за шагом". Кроме того, на нестабильность микросателлитов могут влиять такие факто
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.