ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 338-344
УДК 578.81:578.7
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКЦИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДОВ
Pseudomonas И Staphylococcus
© 2014 г. К. А. Мирошников*, Е. Е. Куликов**, О. С. Дарбеева***, К. А. Лыско****, Г. М. Игнатьев****
*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997
e-mail: kmi@ibch.ru **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 117312 *** "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"Минздрава России, Москва, 119002 **** НПО "Микроген"Минздрава России, Москва, 127473 e-mail: kmi@ibch.ru Поступила в редакцию 25.11.2013 г.
Состав экспериментально подобранных смесей бактериофагов, промышленно выпускаемых НПО "Микроген" для профилактики и лечения стафилококковых и псевдомонадных инфекций, был проверен с помощью просвечивающей электронной микроскопии негативного контрастирования. Результаты биоинформационного анализа геномов известных фагов Pseudomonas и Staphylococcus показали, что основная популяция бактериофагов в смесях принадлежит группам, пригодным для использования в терапевтических целях. Однако поскольку результаты изучения морфологии фаговых частиц не всегда позволяли сделать однозначный вывод о соответствии фага конкретной группе, требуется генотипирование бактериофагов на основе консервативного генетического локуса, которое даст возможность определить их принадлежность к определенной генетической группе.
DOI: 10.7868/S0555109914030258
В последние 20 лет во всем мире наблюдается стремительный рост числа и разнообразия штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к низкомолекулярным антибиотикам. Это стимулировало поиск альтернативных методов лечения и контроля бактериальных инфекций. Естественные вирусные паразиты бактерий (бактериофаги или фаги), широко представленные в биосфере, могут применяться в качестве медицинских препаратов. Бактериофаги широко использовались в практической медицине в первой половине ХХ века до открытия и внедрения антибиотиков. В СССР лечебно-профилактические бактериофаги рассматривались как резерв для противомикроб-ной терапии при необходимости щадящего и узконаправленного антибактериального действия. Прикладные научные исследования бактериофагов, разработка, регистрация и промышленный выпуск фаговых препаратов на фармацевтических предприятиях проводятся в нашей стране более 50 лет. Было приложено много усилий для доведения фаговой терапии до уровня надежного клинического инструмента. В отечественном здравоохранении накоплен обширный опыт успешного применения бактериофагов для лечения и профилактики гнойно-воспалительных инфекции в хирургии, урологии, отоларингологии, педиат-
рии, акушерстве и гинекологии [1—4]. В настоящее время активно обсуждается, можно ли считать фаготерапию, подтвержденную результатами многолетних медицинских наблюдений, эффективным и безопасным методом лечения, а также осуществлять упрощенную регистрацию препаратов, разрешенных к медицинскому применению.
При создании промышленных фагопрепаратов используют природные эмпирически подобранные и адаптированные для производства литиче-ские фаги, активные против современных штаммов возбудителей. Исходная субстанция лечебно-профилактических бактериофагов ("Ва^егюрИа-§иш") представляет собой частично очищенный стерильный фильтрат фаголизатов соответствующих видов бактерий. Для производства конечных форм фаголизаты обычно подвергаются доочист-ке, концентрированию, высушиванию и т.д.
Однако в современных условиях нельзя расценивать "бактериофаг" или "литический бактериофаг" как исчерпывающее описание активного вещества в составе препарата. С точки зрения молекулярной биологии бактериофагов для успешного их применения в терапевтических целях необходимо выполнение ряда условий. Эти условия были сформулированы научным сообществом в 2000-х годах и достаточно логичны с точки зрения
современного знания биологии, генетики и экологии бактериальных вирусов [5—8].
1. Должна быть достаточно хорошо изучена биология лечебного фага. Необходимо проведение количественного анализа динамики процесса фаговой инфекции в различных модельных условиях, а эффективность фаговой терапии должна быть предварительно проверена на соответствующей животной модели.
2. Препараты фага должны содержать инфекционные для бактерий частицы фага в достаточном количестве и стабильно сохранять свои свойства в течение всего заявленного срока годности препарата.
3. Препараты фага должны отвечать всем требованиям безопасности и не иметь бактериальных или иных токсических загрязнений.
4. Необходима проверка иммуногенности фага и фагового препарата. Экспериментально показано, что при кратковременном приеме иммунный ответ на присутствие фагов в организме невелик, не вызывает четко выраженных токсических явлений и не влияет на терапевтический эффект фага. Однако имеются данные, что при продолжительном применении фага вероятна стимуляция адаптивной иммунной системы [9].
5. Применяемые для терапии бактериофаги должны быть литическими, т.е. их развитие должно начаться немедленно после инфицирования и завершаться уничтожением клетки-хозяина. Соответственно в геноме бактериофага не должно содержаться генов, ответственных за интеграцию бактериофага в хромосому бактерии и развитие замедленного лизогенного цикла инфекции. Также некоторые фаги могут нести гены факторов вирулентности или токсинов [10].
6. Желательно знать молекулу-рецептор фага. В популяции из 106—108 бактерий существует вероятность спонтанных мутаций с потерей или изменением рецептора, что снижает эффективность фаговой терапии. Применение нескольких фагов, действующих на разные рецепторы бактериальной клетки, понижает возможность возникновения фагоустойчивости у бактерий [11].
Первые 4 из перечисленных условий выполняются опытным путем и входят в процедуру проведения испытаний и регистрации нового фагового препарата [12]. Для соблюдения последних двух условий было бы оптимально определение полной последовательности генома каждого бактериофага-кандидата для включения в терапевтический препарат. Однако несмотря на колоссальный прогресс в последнее десятилетие методов полногеномного секвенирования, такой анализ остается дорогим и сложным для рутинного применения. Поскольку необходимо будет секвени-ровать тысячи образцов бактериофагов, находящихся в музеях производственных предприятий,
то это приведет к снижению таких преимуществ фаготерапии, как простота, эффективность и дешевизна создания новых препаратов, особенно по сравнению с разработкой и испытанием традиционных низкомолекулярных лекарственных препаратов. В настоящей работе мы предлагаем алгоритм генетической характеристики терапевтических бактериофагов с помощью традиционных молекулярно-биологических методов.
В качестве модельных объектов исследования были выбраны бактериофаги Pseudomonas aeruginosa (синегнойной палочки) и Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка). Эти виды условно-патогенных бактерий вызывают развитие гнойно-воспалительных заболеваний, особенно в госпитальных условиях. Инфицирование пациентов происходит, помимо традиционных путей передачи, при инвазивных методах исследования и катетеризации. Возбудители внутри-больничных инфекций, как правило, устойчивы к большинству антибиотиков благодаря природным и приобретенным механизмам резистентности, что затрудняет выбор антимикробной терапии инфекций, вызванных указанными видами бактерий.
Препараты бактериофагов для профилактики и лечения инфекций, вызванных S. aureus и P. aeruginosa, давно и успешно применяются в ветеринарии и медицине. Бактериофаги псевдомонад и стафилококков репрезентативно изучены. Так, в базе данных GenBank имеется около 75 депонированных полных геномов фагов Staphylococcus и 70 фагов Pseudomonas.
В качестве монопрепаратов, направленных против инфекций с известной этиологией, смеси специфических фагов выпускаются предприятиями НПО "Микроген" под торговыми наименованиями "Бактериофаг стафилококковый" и "Бактериофаг псевдомонас аэругиноза (синегнойный)".
Цель работы — проверка методом электронной микроскопии негативного контрастирования 16 проб промышленных фагопрепаратов, изготовленных на разных производственных площадках и принадлежащих к разным партиям выпуска, на их соответствие современным моле-кулярно-биологическим требованиям и предложение методов контроля их состава.
МЕТОДИКА
Сравнительный анализ геномов бактериофагов Staphylococcus и Pseudomonas, депонированных в базу данных GenBank, проводили с помощью алгоритмов BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBOSS Stretcher (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ emboss_stretcher/) и Progressive Mauve (http:// gel.ahabs.wisc.edu/mauve/). Перед проведением глобального выравнивания геномы были вручную линеаризованы относительно единой стартовой
Таблица 1. Гомологичные группы геномов бактериофагов Pseudomonas и Staphylococcus
Группа Число в Gen Bank Размер геномов, тпн Количество генов Морфология Инфекционный цикл Пригодность для терапии
Бактериофаги Staphylococcus
K 17 127-140 165-216 Myoviridae А1 Литический Пригодны
44AH 4 16-18 20-27 Podoviridae C1 » »
3а 6 43-45 54-67 Siphoviridae B2 Умеренный Непригодны
77 3 42-46 49-60 Siphoviridae B1 » »
фЕТА 25 40-46 65-79 Siphoviridae B1 » »
Orphan 5 40-46 50-62 Siphoviridae B1 » »
Бактериофаги Pseudomonas
PB1 9 64-67 88-94 Myoviridae A1 Литический Пригодны
PaP1 5 89-94 146-161 Myoviridae A1 » »
фкг 3 211-316 211-461 Myoviridae A1 » »
KMV 13 40-45 43-58 Podoviridae C1 » »
Т7 4 37-41 42-52 Podoviridae C1 » »
N4 2 72-75 86-88 Podoviridae C1 » »
LUZ24 2 45 70-71 Podoviridae C1 Варьирует Требуют проверки
M6 3 58-61 77-78 Siphoviridae B2 Литический »
D3 4 56-58 69-96 Siphoviridae B1/B2 Варьирует »
P2 2 35-36 74 Myoviridae A1 Умеренный Непригодны
Lambda 5 36-39 50-58 Siphoviridae B1 » »
F10 1 39 63 Siphoviridae B1 » »
Транспозоны 5 37-39 52-59 Siphoviridae B1 » »
F116 1 65 70 Podoviridae C1 » »
точки перед геном малой субъединицы термина-зы [13
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.