ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 2, с. 230-238
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.174.015.3:598.1.112.6
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ ЛОКУСОВ У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯЩЕРИЦ Darevskia unisexualis
© 2009 г. А. В. Омельченко1' 2, В. И. Корчагин1, Г. А. Севастьянова2, А. П. Рысков1, О. Н. Токарская1
1Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: dna@biogen.msk.su
2Московский педагогический государственный университет, кафедра органической и биологической химии,
Москва 119882; e-mail: biochem_mpgu@mail.ru Поступила в редакцию 14.04.2008 г.
В настоящей работе впервые проведено молекулярно-генетическое исследование динуклеотидных (GT^-микросателлитных локусов у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis. Выявлен и детально охарактеризован полиморфный локус Du214 (GeneBank Ас. № EU252542); показано, что аллели этого локуса различаются по размеру и структуре микросателлитного кластера и точковы-ми мутациями, сочетания которых позволяют выделить устойчивые фиксированные двойные нук-леотидные замены A-A (аллели 2 и 4) и G-T (аллели 1, 3, 5 и 6). Указанные двойные нуклеотидные замены были обнаружены нами также в ортологичных локусах геномов родительских видов D. rad-dei (G-T) и D. valentini (A-A). На основе анализа закономерностей распределения аллельных вариантов данного локуса во всех популяциях партеновида D. unisexualis разработана и реализована математическая модель, с помощью которой рассчитана частота встречаемости аллельных вариантов по всем популяциям вида и генетико-популяционная структура D. unisexualis - выявлен генетический вклад каждой популяции в генофонд этого вида. Полученные данные демонстрируют, что мик-росателлитная изменчивость является одним из факторов клонального и генетического разнообразия партеновидов.
Микросателлитные последовательности, относящиеся к тандемно организованным умеренным повторам ДНК про- и эукариотических геномов, представляют значительный интерес как один из факторов нестабильности генома. Они варьируют по размеру повторяющегося звена от 1 до 6 пн и длине кластера от 20 до 60 звеньев, имеют высокие скорости мутирования от 10-2 до 10-5 [1], что приводит к накоплению популяционно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [2, 3]. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклеотидные микросателлиты, которые являются наиболее эволюционно-консервативными генетическими маркерами [4]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросателлиты человека [5, 6], ряда животных и растений [7]. В то же время однополые виды животных с клональным типом размножения остаются все еще малоизученными как с точки зрения структурной организации их генома, так и с точки зрения генетической изменчивости [8, 9].
D. unisexualis - это один из семи партеногене-тически размножающихся видов скальных яще-
риц Кавказа, характеризуется разорванным ареалом, слагающимся из ряда разных по величине изолированных популяций Северо-Восточной Турции и Армении, состоящих из генетически идентичных особей одного пола [10]. Как и другие партеногенетические виды этого рода, D. unisexualis имеет гибридное происхождение (родона-чальные виды D. valentini и D. raddei), характеризуется диплоидным набором хромосом, высоким уровнем гетерозиготности аллозимных локусов [11, 12] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [13, 14]. Ранее нами с помощью локус-специфического ПЦР-анализа был выявлен внутривидовой полиморфизм по тетрануклеотидным локусам, содержащим (GATA^-микросателлитные кластеры у партеновидов (D. unisexualis, D. armeniaca, D. dahli) и двуполых видов (D. raddei, D. valentini, D. mixta) рода Darevskia [15]. Целью настоящей работы является молекулярно-генетическое исследование динуклеотидных микросателлитных локусов (TG^-типа у партеновида D. unisexualis и двуполых видов D. raddei и D. valentini.
Таблица 1. Условия ПЦР-амплификации четырех микросателлитных локусов партеновида D. unisexualis
Название локуса Пара праймеров Температура отжига, °С
Du231 (Ac. № EU252540) 5'TCAAGAGGCCTCCCGAAAAG 3' (F) 56
5'TGAGCCAGCTACCGTCATTCA3' (R)
Du365 (Ac. № EU252543) 5'GGGGCCCATTGTGTAAATACTGTA 3' (F) 55
5'GGATTAAGGGGTTTTCTCAGGACA 3' (R)
Du255 (Ac. № EU252541) 5'TCGCAGAGTGGCAGGAAACAAT 3' (F) 58
5'TGCATCCAGCTCAACCAAAATACC 3' (R)
Du214 (Ac. № EU252542) 5'TCACTTAAGGTTGACGCTGACTCA 3' (F) 50
5'CTGAACAAGTTGTCCACCTCTGC 3' (R)
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе была использована ранее полученная геномная библиотека D. unisexualis [16]. Методом гибридизации с колониями, используя олигонук-леотидные зонды, были отобраны и секвенирова-ны рекомбинантные клоны, содержащие микросателлиты (GT^-типа, которые помимо (TG^-ди-нуклеотидных содержали также другие типы динуклеотидных мотивов. Анализ полиморфизма этих локусов проводили с помощью локус-специ-фической ПЦР на популяционных выборках ДНК D. unisexualis и двуполых видов - D. raddei и D. valentini. Кровь самок D. unisexualis из пяти природных популяций Армении - Центральной (Такярлу, Кутчак) и побережья оз. Севан (Лчап, Норатус, Загалу) (N = 65), а также четырех популяций D. raddei (N = 24) и трех популяций D. valentini (N = 18) из Центральной и Северной Армении консервировали в 0.05 М ЭДТА рН 8.0 и хранили при +4°С. Образцы ДНК были выделены стандартным фенольно-хлороформным методом с использованием протеиназы К [17]. В качестве праймеров для монолокусного ПЦР были использованы олигонуклеотиды, указанные в табл. 1. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси (50 нг ДНК) с использованием набора для ПЦР GenePak® PCR Core ("Isogene Lab.ltd", Россия) в четырехканальном ДНК-амплификаторе "Терцик" (ТП4-ПЦР-01, "ДНК-технология", Россия) при следующих температурных режимах: де-
Таблица 2. Молекулярная характеристика (GT^-локусов
Микросател- Размер
Название локуса литный ПЦР-продукта,
кластер пн
Du231 (Ac. № EU252540) (GT)M; (CT)xq 160
Du365 (Ac. № EU252543) GTGGA(GT)22 254
Du255 (Ac. № EU252541) (GT)22(AT)12 212
Du214 (Ac. № EU252542) (GT)22 223
натурация при 94°С - 3 мин, амплификация в течение 30 циклов (94°С - 1 мин, отжиг праймеров -40 с, 72°С - 40 с); элонгация - 5 мин при 72°С. Разделение аллельных вариантов локусов генома D. unisexualis осуществляли методом денатурирующего гель-электрофореза в 6%-ном ПААГ (40% ПАА (акриламид : бисакриламид - 19 : 1), 50% Urea, 37% формамид) при 60°С в течение 4 часов. Окраску геля осуществляли в соответствии со стандартной методикой Silver Sequence™ DNA ("Promega"). Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации проводили методом Сэнгера с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDyeTM Terminator v.3.1, с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Последовательности выравнивали с использованием программы MegAlign 4.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С помощью ПЦР-амплификации нами было проанализировано четыре динуклеотидных локу-са на выборке из пяти популяций D. unisexualis (65 особей). В табл. 2 приведена структура микросателлитных кластеров клонов, содержащих (GT)n-микросателлиты. Оказалось, что три из исследованных локусов - Du231, Du365, Du255 являются электрофоретически мономорфными и лишь один из них (Du214, Ас. № EU252542) - полиморфен и представлен шестью различающимися по электрофоретической подвижности аллельными вариантами. Данные по частоте встречаемости аллелей Du214 указаны в табл. 3. В частности, аллели 2 и 3 в одинаковом числе встречаются в популяциях Лчап, Загалу и Норатус. Популяция Такярлу содержала три аллеля - варианты 1, 2 и 3. Популяция Кутчак оказалась наиболее вариабельной - ее особи являлись носителями пяти аллельных вариантов.
ПЦР-продукты каждого аллельного варианта были далее клонированы и секвенированы. На
Таблица 3. Количественная оценка вариабельности лoкycа Du214 y партеновида D. unisexualis
ПОПУЛЯЦИЯ Аллельный вариант Общее чисто
l 2 З 4 5 б ошбей
Кутчак 0 8 7 2 2 l l0
Лчап 0 l0 l0 0 0 0 l0
Загалу 0 ll ll 0 0 0 ll
Нopатyc 0 17 l7 0 0 0 l7
Такярлу l2 17 5 0 0 0 l7
По вшм популяциям l2 бЗ 50 2 2 l б5
рис. 1 представлены нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du214. Все аллели локуса Du214 различаются по длине микросателлитного кластера за счет различий в числе (ОТ)-повторов. Интервал различий составляет от 22 до 29 мономеров. Кроме того, как видно из данных рис. 1, аллели Du214 у D. unisexualis различаются также и точковыми мутациями в начале микросателлитного кластера. Сочетания таких фиксированных точковых мутаций образуют двойные нуклеотидные замены G-T (аллели 1, 3, 5, и 6) и A-A (аллель 2 и 4), которые являются специфическими маркерами для каждого аллеля, предположительно наследуемыми от разных дву-
полых родительских видов. Для доказательства этого предположения мы провели ПЦР-ампли-фикацию ДНК двуполых видов D. raddei и D. valentini (рис. 2). На рис. 2 представлены данные электрофоретического фракционирования ПЦР-продуктов ортологичных локусов родительских видов, из которых видно, что бисексуальные виды гетерозиготны и гетерогенны по локусу Du214. На рис. 3 показаны нуклеотидные последовательности ДНК вариабельных участков этого локуса у родительских видов. Видно, что ал-лельные варианты различаются не только длиной микросателлитного (GT^-кластера, но и характерными единичными нуклеотидными за-
1O
2O
3O
4O
6O
7O
allele 1 С т ÇS «ST "CT ССЛ СО Т r;7 ПССС Т С> í Л GT Т Cs GA''ä Ci 'Л GA т т " G GC" 1 CCÍG7 " " Т GA ССТ 70
allele2 7O
allele3 7O
allele4 7O
allele5 '...''.'■'...' . 70
allele6 ■■...■■■■■..■ ■ ■ ■ ■ 70
1O
12O
13O
H40
allele 1 allele2 allele3 allele4 allele5 allele6
CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA
GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT ■ ■ -
GTAAGTGTGT GTGT GTGT GTGTGT GTGT GTGT GT GTGT GTGT GT.........
GT GT GTGTGT GTGT GTGT GTGTGT GTGT GTGTGT
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.