ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 433, № 3, с. 406-409
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 578.816 (282.256.341)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ Т4-БАКТЕРИОФАГОВ В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ © 2010 г. Т. В. Бутина, О. И. Белых, С. И. Беликов
Представлено академиком М.А. Грачёвым 04.02.2010 г. Поступило 08.02.2010 г.
В последнее время все большее внимание уделяется изучению вирусов водных экосистем. Известно, что вирусы оказывают существенное влияние на многочисленные биогеохимические процессы в водоемах, эффективно регулируют численность, структуру и видовое разнообразие бактерий и фитопланктона [1, 2]. Наиболее распространенными вирусами бактерий являются фаги с хвостовыми отростками (96%), объединенные в отряд Cau-dovirales, который в зависимости от размеров и сократимости хвостов разделяют на три семейства: Siphoviridae, Podoviridae, Myoviridae [3]. Для Myoviridae характерны фаги с сократимым хвостом, они в большом количестве обитают в морских и пресных водоемах и имеют широкий круг хозяев среди эубактерий и архей. Одним из наиболее известных родов семейства Myoviridae является род Т4-подобные фаги ("T4-like viruses"), обладающие высокой литической активностью и вызывающие гибель клетки хозяина [4]. Показано, что в результате вирусного лизиса смертность гетеро- и автотрофных бактерий достигает 30— 60% [1].
Целью данной работы явилась идентификации Т4-бактериофагов в оз. Байкал с помощью генетических маркеров. В последнее время разработан ряд вырожденных праймеров для выявления бактериофагов определенных таксонов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в природной среде. В настоящей работе использовали молекулярные маркеры к гену g23, кодирующему основной капсидный белок Т4-бактерио-фагов [5].
Первые сведения о наличии и количестве вирусных частиц в байкальской воде получены недавно, их максимальная концентрация по данным эпифлуоресцентной микроскопии составила 5.92 млн. частиц/мл [6]. Электронно-микроскопическое изучение вириопланктона показало значи-
Лимнологический институт
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Иркутск
тельное разнообразие бактериофагов в пелагиали Южного Байкала и позволило классифицировать их на основе морфологических признаков [7]. Высокая численность и разнообразие вирусов в байкальской воде указывали на то, что они являются существенным компонентом экосистемы, оказывающим влияние на динамику численности различных видов планктона и продуктивность озера в целом.
Пробы воды были отобраны 2 июня 2008 г. в пелагиали Северного Байкала на середине разреза Байкальское—Турали на разных глубинах от 0 до 50 м. Для учета численности бактерий и ци-анобактерий пробы, фиксированные формальдегидом до конечной концентрации 2%, фильтровали через поликарбонатные фильтры "Millipore" с диаметром пор 0.45 мкм и наблюдали в световой микроскоп Axiovert 200 ("Zeiss", Германия), снабженный ртутной лампой HBO 50 и наборами фильтров для флуоресцентной микроскопии.
Для выявления Т4-бактериофагов пробы с глубин 5 и 10 м объемом 0.5 л фильтровали через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 1.2 и 0.2 мкм для удаления зоо-, фито- и бактерио-планктона. Далее материал концентрировали на фильтрах из оксида алюминия с диаметром пор 0.02 мкм (Anodisc, "Whatman"). В качестве матрицы для ПЦР использовали суммарную ДНК, выделенную с 0.02-микрометровых фильтров с помощью набора ДНК-сорб ("ИнтерЛабСервис"). Условия ПЦР соответствовали рекомендованным авторами [5]. Амплифицированные фрагменты в диапазоне от 380 до 600 п.н. клонировали с помощью набора InsTAclone ("Fermentas") и определяли нуклеотидные последовательности на автоматическом секвенаторе CEQ 8800 Beckman Coulter (США).
В результате работы определены нуклеотидные последовательности 23 клонированных фрагментов гена g23 фагов из интегральной пробы байкальской воды. Полученные структуры депонировали в GenBank (номера: FJ798929-FJ798951). На основе выведенных аминокислотных последовательностей фрагмента g23 проведен филогенетический анализ.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
407
В начале июня северная котловина оз. Байкал характеризовалась массовым развитием пико-планктонных цианобактерий — представителей родов Synechococcus, Cyanobium и Synechocystis. Среди них доминировал эндемичный вид байкальского автотрофного пикопланктона — Synechocystis limnetica, составляя 20% от общей численности пикоцианобактерий в слое 0—25 м. В другие сезоны по нашим данным вклад S. limnetica в общую численность не превышал 4%. Концентрация пикоцианобактерий в целом изменялась незначительно по глубинам и составляла в среднем 250 тыс. кл/мл. Доля пикоцианобак-терий в общей численности всего бактериопланк-тона составила 50%.
Все известные Т4-бактериофаги разделяют на 4 подгруппы на основе сравнения последовательностей трех основных структурных белков (g18, g19, g23): T-, PseudoT-, SchizoT- и ExoT-evens [4]. Большинство штаммов, принадлежащих подгруппе T получено от энтеробактерий. Изоляты от патогенных и условно-патогенных бактерий родов Acinetobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Burkholderia и Vibrio (http://ictvonline.org/index.asp) принадлежат к подруппам PseudoT или SchizoT. В подгруппу ExoT вошли изоляты от морских цианобактерий: штаммы P-SSM2 и P-SSM4 получены от Prochlo-rococcus spp., штамм S-PM2 выделен от Synechococcus sp. [8, 9]. Недавние исследования g23-генов некультивированных Т4-бактериофагов водных биоценозов выявили большое разнообразие и широкое распространение этих вирусов in vivo. По итогам филогенетического анализа выделено дополнительно 5 подгрупп морских Т4-фагов (I—V) и две подгруппы фагов биоценозов рисовых полей (Rice Soil и Rice Straw) [5, 10].
Исходя из этих данных, нами были выбраны последовательности фрагмента гена g23 культивированных (http://phage.bioc.tulane.edu) и некультивированных Т4-фагов всех определенных к настоящему времени подгрупп. Из базы данных GenВank получены последовательности g23 из следующих образцов воды: Северного Ледовитого океана (глубина 3 км) - CS4 (AAZ17619), CS6 (AAZ17627), CS25 (AAZ17624), CS34 (AAZ17629), CS41 (AAZ17616); Мексиканского залива Атлантического океана (глубина 110 м) — 3В1 (AAZ17632), 3В6 (AAZ17640), 3В16 (AAZ17643), 3В28 (AAZ17648), 3В31 (AAZ17635), 3В32 (AAZ17649); Тихого океана, побережья Британской Колумбии (поверхностные воды) — 37329N (AAZ17581), 37332 (AAZ17569), 37510 (AAZ17585), 37538 (AAZ17583), 48510 (AAZ17603), 48520 (AAZ17600), 48523 (AAZ17601); японских рисовых полей S-1 (AB284329), S-5 (AB284332), S-12 (AB284336), S-13 (AB284337), S-14 (AB284338), R-1 (AB284342), R-2 (AB284343) и R-5 (AB284344). К настоящему времени в опубликованной литературе и базе данных
GenBank сведения о структуре гена g23 Т4-фагов из пресноводных водоемов отсутствуют.
Филогенетическое древо, представленное на рис. 1, получено с помощью программы MEGA 4.0. [11] методом ближайших соседей без учета де-леций. В результате филогенетического анализа установлено, что 39% полученных последовательностей байкальских вирусов принадлежит к подгруппе ExoT, включающей Т4-цианофаги. По результатам исследований морских экосистем структуры Т4-цианофагов выявлены только в поверхностных водах, где наблюдается максимальная численность прокариотического автотрофного пикопланктона, представленного видами Synechococcus spp. и Prochlorococcus spp. [5, 12]. Принимая во внимание результаты количественной оценки структуры байкальского пико-планктона и данные филогенетического анализа, можно предположить, что обнаруженные нами последовательности, отнесенные к группе ExoT, принадлежат именно фагам, инфицирующим ав-тофототрофные, а не гетеротрофные бактерии.
Автотрофный пикопланктон (АРР), состоящий в Байкале в основном из пикопланктонных цианобактерий, играет важную роль в экосистеме озера, его массовое развитие происходит ежегодно в конце июля — августе, максимальная концентрация может достигать 2—3 млн. кл/мл [13, 14]. Показано, что в это время он производит до 80% первичной продукции и служит основным пищевым ресурсом в трофической цепи озера [13]. В августе по нашим данным вклад АРР в общую биомассу фитопланктона достигал 71%, в концентрацию хлорофилла а — 89% [14]. В начале июня 2008 г. в Северном Байкале в отличие от других котловин озера отмечался низкий уровень развития фитопланктона, его биомасса составляла 133 мг/м3, вклад пикоцианобактерий в общую биомассу фотоавтотрофов был высоким (более 50%). Таким образом, несмотря на то, что пик развития цианобактерий еще не наступил, в исследуемый период АРР являлся одним из основных производителей первичной продукции и источником пищи для консументов.
В отличие от других водных биоценозов [5, 10] в проанализированном образце байкальской воды последовательности g23-rern, близкие последовательностям Т4-бактериофагов подгрупп T, SchizoT и PseudoT, не выявлены. Микробиологический анализ байкальской воды в северной котловине озера также не выявил наличия фагов E. coli [15]. Поскольку известные фаги подгрупп Т, PseudoT и SchizoT инфицируют патогенные и условно-патогенные бактерии, отсутствие этих вирусов в воде может служить дополнительным индикатором чистоты воды.
Остальные клонированные последовательно -сти байкальских фагов, по нашим данным, наиболее близки к некультивированным бактерио-
408
БУТИНА и др.
Рис. 1. Филогенетическое древо, полученное на основе аминокислотных последовательностей g23 Т4-бактериофагов семейства Myoviridae. Структуры известных изолятов Т4-бактериофагов выделены курсивом и подчеркнуты. Остальные структуры принадлежат клонированным последовательностям некультивированных бактериофагов из природных образцов. Последовательности бактериофагов, полученные из оз. Байкал, выделены жирным шрифтом.
IV, V
Rice Soil
SchizoT
PseudoT
0.05
фагам из природных образцов, принадлежащих к подгруппам II, IV, V и к одному из кластеров Т4-фагов рисового биоценоза (рис. 1). Следует отметить, что разделение некультивированных морских Т4-бактериофагов и фагов рисовых биоценозов на подгруппы I—V, Rice Soil и Rice Straw носит предварительный характер, поскольку оно ос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.