научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НОВЫХ ШТАММОВ ANABAENA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНО-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НОВЫХ ШТАММОВ ANABAENA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНО-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 5, с. 639-646

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 579.25:575.2

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НОВЫХ ШТАММОВ ANABAENA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНО-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА © 2010 г. Л. Е. Михеева1, Н. В. Белавина, Е. А. Карбышева, С. В. Шестаков

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики

Поступила в редакцию 12.11.2009 г.

Экосистемы рисовых полей являются хорошим источником новых штаммов гетероцистных цианобакте-рий, пригодных для применения в биотехнологических системах продукции фотоводорода. Изучены морфологические и физиологические свойства двух новых эпифитных штаммов цианобактерий — Ana-baena sp. 182 и Anabaena sp. 281. Проведено ДНК-типирование этих штаммов на основе ПЦР-амплифи-кации генов гидрогеназ и ДНК-анализа с RAPD- и Rep-праймерами. Штамм Anabaena sp. 281 по геномным характеристикам существенно отличается от двух референтных штаммов с секвенированными геномами (Anabaena variabilis АТСС 29413 и Nostoc sp. PCC 7120), тогда как штамм Anabaena sp. 182 является близкородственным штамму A. variabilis АТСС 29413. Благодаря ряду физиологических и биохимических преимуществ штамм Anabaena sp. 182 может рассматриваться в качестве нового перспективного объекта генетических и генно-инженерных исследований, направленных на создание продуцентов молекулярного водорода.

Ключевые слова: цианобактерии, Anabaena, фотопродукция водорода, генотипирование, повторы ДНК.

Цианобактерии являются древней группой фо-тосинтезирующих микроорганизмов, широко распространенных в различных экологических нишах. Они служат исходным материалом для скрининга штаммов-продуцентов биологически активных соединений, аммония и фотоводорода. К числу объектов биотехнологии относятся штаммы филаментоз-ных азотфиксирующих цианобактерий Anabaena и Nostoc как свободноживущих, так и выделенных из симбиотических ассоциаций с растениями и грибами. Именно гетероцистные цианобактерии и их мутанты являются наиболее вероятными кандидатами для создания перспективных систем фотопродукции водорода [1—3].

Целью нашей работы было проведение молеку-лярно-генетического исследования двух новых эпи-фитных штаммов цианобактерий рода Anabaena, выделенных из ассоциаций с растениями риса. Эти изоляты изучены в сравнении с модельным штаммом свободноживущей цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413, геном которой полностью се-квенирован (http://genome.jgi-psf.org/microbial/ana-va.home.html). Основное внимание уделено анализу характеристик, связанных с возможностями использования новых штаммов в качестве потенциальных продуцентов молекулярного водорода.

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: lidamikheeva@yan-dex.ru).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали лабораторный штамм азотфиксирующей цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413 и два новых штамма, выделенных с листьев растений риса сорта IR22 во Вьетнаме — Anabaena sp. 182 и Anabaena sp. 281 (любезно предоставлены проф. Нгуен Тхань Хьен, Ханойский ун-т). В молекулярно-генетическом анализе в качестве референтных штаммов использовали также полученный от проф. П. Уолка (Университет штата Мичиган, США) штамм Nostoc {Anabaena) sp. PCC 7120 с секве-нированным геномом (http://wiki.kazusa.orjp/Ka-zusa:CyanoBase:Anabaena_sp._PCC_7120) и штамм Anabaena siamensis, изолированный из почвы рисовых полей Таиланда и предоставленный проф. С. Бо-уссиба (Израиль).

Культуры выращивали при 30°С и люминесцентном освещении с интенсивностью 40 мкЕ х х (м-2 с-1) на среде BG11 [4] или BG11C (без добавления NaNO3) в конических колбах с 40-50 мл среды. Скорость роста определяли спектрофото-метрически при 540 нм.

Культивирование в микроаэрофильных условиях для полуколичественного определения выделения водорода осуществляли в градуированных пробирках со шлифами объемом 8 мл. Двухсуточные азот-фиксирующие культуры сгущали с помощью центрифугирования до OD540 = 1.5-2.0 в среде роста BG11o с добавлением 5 мМ фруктозы и 2 х 10-5 М дихлорофенилдиметилмочевины (DCMU), запол-

Таблица 1. Праймеры, использованные для ПЦР-амплификации

Праймеры Нуклеотидная последовательность Forward/Reversed (5' —3') Температура отжига в ПЦР реакции, °С Размер амплифицируемого фрагмента ДНК A. variabilis*, пн

1-2 hupS CCTGGTGGTAGTTCTTTGGGT/ CGAAGAACCGACAGTATGCGA 50 810

3-4 hupL TGAACTCGTGCAAGTTGACG/ GGTTTCTATTGGCGTATGGG 50 497

5-6 hupSLMid GCTAAGATGGCGTTGCG/ GGACAACGCAAAGGCTG 48 659

7-8 hoxH GAAGGTCACGCCAAGATTAGTAT/ GATTCCTGCTTCTACACGATTGA 50 1299

9-10 hoxYH CCACTATTACAAGGCAAAACACCAC/ CTTCACTCACACCAACGGCTTCTAA 54 1969

11-12 orf2 hox TGGGATTATTAGTGAGAGCGA/ GCGATTTTGCTAACTTTTTCA 48 414

Rep1 GCTACAACGGGGGGAAC 50 1648

Rep2 GGATACTGTTGGCGAAT 48 1818, 3375

Rep3 TCGTAGGGTGGGCAATG 50 1396 + (1095, 1121, 1750)**

CRA22 CCGCAGCCAA 40 Не определяли

CRA25 AACGCGCAAC 40 »

OPA 11 CAATCGCCGT 40 »

* Размеры фрагментов определены на основании локализации праймеров в ДНК A. variabilis с помощью программы BLASTN. ** Вероятные продукты амплификации с праймерами, укороченными с 5'-конца (длиной не менее 11 пн).

няли пробирки до шлифа с вытеснением воздуха и инкубировали 24—48 ч при освещенности 50 мкЕ х х (м-2 с-1).

Активность нитрогеназы (НГ) определяли как описано ранее [5] по скорости восстановления ацетилена в ходе инкубации 2 мл культуры при освещенности 50 мкЕ х (м-2 с-1) в течение 1-2 ч в атмосфере воздуха с добавлением 10% ацетилена в герметично закрытых флаконах объемом 14 мл. Перед добавлением ацетилена флаконы преинкубировали в тех же условиях на свету в течение 15 мин.

Содержание белка в суспензии определяли по методу Лоури после лизиса клеток в 1 N NaOH в течение 20 ч при 37°С.

Частоту образования гетероцист в культурах определяли методом микроскопии при подсчете не менее 1000 клеток.

Подбор праймеров проводили с помощью программы Oligo на основе нуклеотидной последовательности генома A. variabilis ATCC 29413 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi). Список использованных RAPD-праймеров, праймеров для повторяющихся нуклеотидных последовательностей (Rep) и для генов водородного метаболизма приведены в табл. 1 и на рис. 1.

Поиск повторяющихся последовательностей проводили по программе, разработанной в Институте цитологии и генетики СО РАН [6] (http://www-mgs.bionet.nsc.ru/mgs/programs/lzcomposer/). Поиск

гомологичных последовательностей проводили с помощью программы BLASTN (http://blast.ka-zusa.or.jp/blast_search/cyanobase/genomes).

Геномную ДНК выделяли из замороженных при —20°С клеток путем механической обработки стеклянными шариками в присутствии додецилсульфа-та натрия и хлороформа [7].

ПЦР (полимеразная цепная реакция) амплификацию проводили в объеме 25 мкл с наслоением минерального масла на амплификаторе Amply4 фирмы "Биоком". Реакционная смесь, приготовленная на основе набора PCR Master Mix (" Fermentas"), содержала 1 единицу Та#-полимеразы, 2 мМ Mg Cl2, по 0.2 мМ дезоксинуклеотидов, 10 нг матричной ДНК, 2 пмоля праймеров (для RAPD-анализа — 100 нг ДНК и 10 пмолей праймера). Амплификацию со стандартными и Rep-праймерами проводили по следующей процедуре: начальная денатурация 94°С — 2 мин, 30 циклов 94°С — 60 с, температура отжига специфического праймера — 60 с, 72°С — 2 мин; завершающий синтез 72°С — 10 мин. Для ПЦР-амплификации с RAPD-праймерами применяли методики, использованные для RAPD-ана-лиза цианобактериальной ДНК [8], с небольшими модификациями: начальная денатурация 94°С — 2 мин, 30 циклов 94°С - 30 с, 40°С - 30 с, 72°С - 60 с; завершающий синтез 72°С — 5 мин. При мультиплексной RAPD-ПЦР добавляли эквимолярные концентрации двух праймеров. Все реакции амплификации повторяли не менее трех раз. Продукты

(a) 9 11 12 7 10 8

hoxU orf 1 hoxY 1-'-■-» 1-r--=r 1-r"- orf 2 hoxH

1-u-^ 1-u>* 1-U--

(б) 500 Пн

3 4 5 1 6 2

_hupL ---- hupS

Рис. 1. Генетическая схема hox (a)- и hup (Ь)-кластеров генов A. variabilis с указанием местоположения специфических праймеров (1-12).

амплификации разделяли путем электрофореза в агарозном геле согласно стандартным методикам. ТАЕ-буфер содержал 0.7% агарозы для анализа продуктов ПЦР со стандартными праймерами и 1.5% — для ПЦР с STRR- и RAPD-праймерами. В качестве молекулярного стандарта размеров фрагментов ДНК использовали 1 kb-маркер ("Fermentas").

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 2 приведены ростовые, морфологические и физиологические характеристики трех штаммов Anabaena. Изучение способности штаммов использовать экзогенные моно- и дисахара при миксо-трофном (среда Bg11Q на свету) или гетеротрофном (среда Bg11Q в темноте) росте показало, что все три штамма являются факультативными гетеротрофа-ми, хорошо растущими в темноте с использованием фруктозы (>5 мМ). Штамм Anabaena sp. 281 обладает

также способностью к гетеротрофному росту с использованием глюкозы.

Штамм Anabaena sp. 182 характеризуется высокой скоростью роста в безазотистой среде, что коррелирует с большой частотой образования гетеро-цист и высокой активностью нитрогеназы в этих условиях. Штаммы A variabilis и Anabaena sp. 182 способны выделять значительное количество водорода в микроаэрофильных условиях (в присутствии DCMU) при инкубации с фруктозой в качестве источника энергии и электронов [9]. В этих условиях наблюдается зависимая от фруктозы продукция водорода при снижении скорости роста культуры. Эти данные указывают на сходство в системах регуляции процесса азотфиксации и сопряженного с ним процесса поглощения водорода у штаммов A variabilis и Anabaena sp. 182. Однако новые штаммы отличаются от A. variabilis по картине подавления образования гетероцист (и нитрогеназы) при добавлении в среду

Таблица 2. Морфологические и физиолого-биохимические свойства штаммов Anabaena

Штамм Интенсивность роста на свету в жидкой среде*, OD540 Частота гетеро-цист при росте в жидкой среде**, % Активность нитрогеназы в аэрофильных условиях*** Образование водорода в мик-роаэрофильных условиях Способность к образованию подвижных гормогониев при росте на плотной среде

Bg11o Bg11 Bg11o + 5 мМ фруктоза Bg

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком