Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»
279
неза в условиях дополнительной митогенной нагрузки предиктором ранних репродуктивных потерь является клеточная гиперпродукция ^-2, компенсированной плацентарной недостаточности - повышение митоген-индуцированной клеточной продукции ГЬ-1р.
2. Оценка функционального резерва им-мунокомпетентных клеток в экспериментальных условиях в ранние сроки беременности представляет собой дополнительный
инструмент прогнозирования гестационных осложнений и прерывания беременности в первом триместре.
Работа поддержана Грантом РФФИ и РФФИ-Урал № 13-04-96080.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рыжикова С. Л., Дружинина Ю. Г., Рябичева Т. Г., Вараксин Н. А. Клиническая лабораторная диагностика 2011, 11, 49-53.
CYTOKINE PRODUCTION IN EARLY PREGNANCY, DEPENDING ON THE PREGNANCY OUTCOME
Gazieva I. A., Chistyakova G. N., Remizova I. I.
"Ural Research Institute of Maternity and Infancy" of the Ministry of Health of Russia, Ekaterinburg, Russia
To identify features of the production of cytokines in early pregnancy, related to pregnancy outcome analyzed the survey results 256 women. It was established that the early pregnancy complicated later by subcompensated placental insufficiency is associated with increased serum levels of IL-ip and IL-1RA. Risk factor of subcompensated placental insufficiency and pregnancy losses in the first trimester is the increased mitogen-induced blood cells synthesis of IFN-y. Increase in mitogen-induced interferonogenesis before early reproductive losses accompanied by the cell overproduction of IL-2, and predictor of compensated placental insufficiency is increase of mitogen-induced cellular production of IL-ip.
Key words: early reproductive losses, placental insufficiency, cytokine production
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ р-ДЕФЕНСИНОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ПАРОДОНТИТЕ
Ганковская Л. В.1, Свитич О. А.3, Саркисян Н.Г.2,4, Молчанова Е.А.1, Русанова К. В.1, Долгих М. А.4
'ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, 2ФГБУН Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург; 3ФГБУ «НИИ ВС им. И. И. Мечникова» РАМН, Москва, 4ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, Екатеринбург, Россия
Последние исследования подтверждают важную роль противомикробных пептидов, и в частности ^-дефенсинов, в поддержании здорового состояния пародонта, а также в возникновении воспалительных заболеваний. Цель настоящей работы - изучение ассоциации полиморфных маркеров гена ОЕГБ1 (-20) и ОЕГБ1 (-44) с развитием пародонтита, а также исследование экспрессии гена НВБ-2 в эпителиальных клетках пародонта. Определение полиморфных маркеров и уровня экспрессии дефенсинов проводили с помощью ПЦР-РВ в присутствие интеркаллирующих красителей и TaqMan зондов. В группе больных с па-родонтитом частота встречаемости варианта AG полиморфного маркера ВЕГБ1 О (-20) А оказалась достоверно выше, чем в группе сравнения: 0,86 по сравнению с 0,56. В группе больных хроническим бактериальным пародонтитом в 60% случаев экспрессия НВБ-2 эпителиальных клетках пародонта резко снижалась в 3,7 раза. Таким образом, выявлены экспрессионные и генетические показатели в генах дефенсинов, которые могут быть маркерами развития/протекции пародонтита.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, дефенсин, пародонтит, полиморфизм, экспрессия
Введение. Хронический пародонтит представляет собой воспалительное заболевание, возникающее под воздействием небольшой группы грамотрицательных бактерий [1]. В настоящее время активно изучаются механизмы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в патогенезе пародонтита. Эпителий слизистой пародонта, выполняя функции физического и иммунологического барьера, экспрессирует распознающие рецепторы врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, TLR9 и др.) и секретируют большое количество эффекторных молекул (цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов и др.) [2, 3]. Последние исследования подтверждают важную роль противомикробных пептидов, и в частности ^-дефенсинов, в поддержании здорового состояния пародонта, а также в возникновении воспалительных заболеваний. в-дефенсин 1 экспрессирует-ся эпителиальными клетками слизистых оболочек конститутивно, кодируются геном DEFB1, уровень его экспрессии может определяется полиморфнизмом гена [4]. Дефекты на уровне генов могут являться причиной сниженной экспрессии дефенсинов, тем самым приводить к уменьшению защиты на уровне слизистых, что, в свою очередь, может служить причиной различной восприимчивости к заболеваниям инфекционного генеза. Для настоящего исследования интерес представляли два полиморфных маркера, локализованных в 5'- нетрансли-руемой области гена DEFB1: -20G/A,-44C/G. Установлено, что выбранные маркеры ассоциированы с широким спектром воспалительных заболеваний [5].
Другие дефенсины могут секретировать-ся индуцибельно, к примеру, продукция в-дефенсина 2 (ЫВБ-2) индуцируется при действии патогенов, цитокинов и других факторов [4].
Целью настоящей работы явилось - изучение ассоциации полиморфных маркеров DEFB1 (-20) и DEFB1 (-44) с развитием паро-донтита, а также исследование экспрессии гена ЫВБ-2 в эпителиальных клетках пародонта.
Материал и методы. Исследование было проведено с использованием клинического материала от 44 пациентов, больных хроническим пародонтитом (ХБП), в качестве группы сравнения исследованы здоровые доноры (п=70). Посев на микрофлору из па-
родонтального кармана определялся в лаборатории Инвитро (Москва). В посеве у всех пациентов определялись Porphyromonas Gingivals, Actinobacilus Actinomycetemcomitans, Bacterioides forythus. Для получения биологического материала проводился соскоб эпителиальных клеток из пародонтально-го кармана у каждого пациента в группах с ХГП. Для оценки полиморфных маркеров в 5'-нетранслируемой области гена бета де-фенсина 1 из эпителиальных клеток была выделена ДНК с использованием наборов "К-сорб" (Синтол, РФ). Далее проводили по-лимеразную цепную реакцию в режиме реального времени. Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (Синтол, РФ) а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ» (Синтол, РФ). Реакцию проводили на приборе RotorGene («QIAGEN», Германия) по следующей программе: 95°C 4 минуты; (денатурация ДНК при 95°C 20 сек., отжиг праймеров при 64°C 40 сек) 40 циклов. Системы для проведения ПЦР-РВ для определения исследуемых полиморфизмов была разработаны ранее на кафедре иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова [6].
Для исследования экспрессии гена де-фенсина HBD2 из клинического материала проводили выделение нуклеиновых кислот с использованием набора RNeasy Mini Kit (Quagen, Германия). Выделения ДНК проводили строго по инструкции фирмы-производителя. Далее проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ) и полимераз-ную цепную реакцию (ПЦР). ОТ-реакцию проводили с компонентами из набора «ОТ-1» (Синтол, РФ). Праймеры и зонды для ОТ-реакции и ПЦР были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями ДНК исследуемых генов (последовательности были взяты в базе GenBank) и синтезированы сотрудниками фирмы Синтол (Россия). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (Синтол, РФ) а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» (Синтол, РФ). Все действия по постановке реакции проводились согласно рекомендациям фирмы-производителя. ПЦР проводили в амплификаторе для ПЦР-
Тематический выпуск «(Российский научный форум на Урале»
281
РВ ДТ-96 (ДНК-технология, РФ) с заданной программой: 95°С - 10 минут, (95°С - 20 сек, 60°С- 40 секунд) 40 циклов. Системы для определения экспрессий исследуемых генов были отработаны ранее [7]. Определение уровня экспрессии генов проводилось относительно экспрессии гена (3-актина. Данные по экспрессии исследуемых генов представлены в виде десятичного логарифма от числа копий соответствующего гена относительно 106 копий гена актина.
Статистическая обработка данных проводилась в программе Microsoft Excel 2007, а также с использованием статистического пакета «STATISTICA 6.0». Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий по экспрессии исследуемого гена применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Для оценки достоверности различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров применяли критерий ^2 [8]. Различия между показателями в группах считались достоверными, если p<0,05.
Результаты и обсуждение. Противоми-кробный пептид - HBD-1 экспрессируется конститутивно и играет большую роль в защите слизистых оболочек ротовой полости. Экспрессия HBD-1 в основном определяется генетическим полиморфизмом 5'-нетрансли-руемой области гена DEFB1. При анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера G (-20) A гена DEFB1 в исследуемых группах обнаружено достоверное (р=0,0014) снижение частоты генотипа GG в основной группе по сравнению с показателем в группе здоровых доноров. Частота генотипа GG в группе сравнения составлял 0,1, в то время как в исследуемой группе частота данного генотипа составила 0,03. Частота встречаемости генотипа AG того же полиморфного маркера DEFB1 G (-20) A оказалась достоверно выше, чем в группе сравнения: 0,86 по сравнению с 0,56. Частота встречаемости генотипа AA полиморфного маркера DEFB1 G (-20) A достоверно не отличалась в исследуемых группах.
При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера С (-44) G DEFB1 выявлено недостоверное (р>0,05) снижение частоты встречаемости генотипа CG по сравнению с контролем. Генотип CC встречался в исследуемой выборке чаще,
чем в группе сравнения (0,45 в исследуемой выборке по сравнению с 0,37 с контрольной группой). Достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов данного полиморфизма в группе пациентов с пародонти-тами и в группе здоровых доноров выявлено не было.
Несмотря на важную роль сли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.