ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 4, с. 540-552
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.17:599.9
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТРОЙ ПЕРЕМЕЖАЮЩЕЙСЯ ПОРФИРИИ В РОССИИ: МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНЕ ПОРФОБИЛИНОГЕНДЕЗАМИНАЗЫ
© 2010 г. В. Л. Сурин, Ю. А. Лучинина, Д. С. Селиванова, Я. С. Пустовойт, И. В. Карпова,
А. В. Пивник, А. В. Лукьяненко, С. К. Кравченко
Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 125167;
е-таП: vadsurin@mail.ru Поступила в редакцию 30.01.2009 г.
Острая перемежающаяся порфирия (ОПП) — заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования, обусловленное частичным дефицитом порфобилиногендезаминазы (ПБГД), одного из ключевых ферментов системы биосинтеза гема. Данная работа посвящена молекулярно-генетиче-скому исследованию ОПП в России, в ходе которого осуществлен успешный мутационный анализ гена ПБГД для 70 неродственных пациентов. Выявлено 47 различных генных дефектов, 28 из которых ранее в мировой популяции не встречались. Наиболее распространенными в России оказались мутации 53ёе1Т и А§173Тгр (встретились по 8 раз, суммарно около 23%). Микроделеция 53ёе1Т имеет монофилетическое происхождение и найдена только в России. Проведено молекулярно-генети-ческое обследование 132 родственников больных ОПП из 40 семей, среди которых выявлено 52 латентных носителя заболевания. Низкая пенетрантность ОПП (около 10%) свидетельствует о том, что мутация в гене ПБГД является необходимым, но не достаточным условием клинического проявления болезни. Ранее была показана модуляция пенетрантности эритропоэтической протопор-фирии через сонаследование мутантного аллеля и функционально неполноценного аллеля дикого типа гена феррохелатазы. Мы проверили гипотезу о существовании аналогичного механизма для ОПП. Секвенирование полноразмерных генов ПБГД у неродственных больных ОПП, $МР-анализ и анализ аномально сплайсированной мРНК ПБГД показали, что в случае ОПП данная гипотеза неверна и пенетрантность этого заболевания определяется какими-то другими факторами.
Порфирия имеет семь нозологических форм, каждая из которых ассоциирована с дефицитом одного из ферментов системы биосинтеза гема [1]. Острая перемежающаяся порфирия, врожденная копропорфирия и вариегатная порфирия образуют группу острых печеночных порфирий. Все острые порфирии имеют менделевский аутосомно-доми-нантный тип наследования. Кроме печеночных порфирий доминантно наследуются также эритро-поэтическая протопорфирия (ЭПП) и врожденный вариант поздней кожной порфирии (ПКП). Для острых порфирий характерно накопление тех или иных токсичных промежуточных продуктов порфиринового обмена в зависимости от дефицитной метаболической стадии, избыток которых и приводит к фенотипическому проявлению болезни в виде периодических приступов, носящих, как правило, неврологический характер и представляющих серьезную угрозу для жизни пациентов. Приступы провоцируются определенным набором эндогенных и экзогенных факторов (лекарственные препараты, алкоголь, изменение гормонального статуса и др.), стимулирующих экспрессию синте-
тазы дельта-аминолевулиновой кислоты (АЛА-С) — первого фермента в цепи биосинтеза гема.
Острая перемежающаяся порфирия (ОПП) является наиболее тяжелой и распространенной формой порфирии (по оценкам в разных популяциях больных — от 1 : 10 000 до 1 : 50 000, латентных носителей - от 1 : 1500-2000 до 1: 7500) [2-4]. Заболевание вызывается частичным дефицитом фермента порфобилиногендезаминазы (ПБГД), также известного как оксиметилбилансинтетаза (номенклатура HUGO). ПБГД катализирует третью стадию биосинтеза гема, во время которой происходит последовательное дезаминирование и конденсация четырех молекул порфобилиногена с образованием нестабильного линейного тетрапиррола 1-оксиме-тилбилана [5]. Клинически заболевание чаще всего проявляется после достижения половой зрелости и характеризуется острыми приступами, включающими брюшные боли, гипертензию, тахикардию и различные нарушения в функционировании периферической и центральной нервной системы.
Ген ПБГД был клонирован и секвенирован в 1986 г. [6]. Он локализован на хромосоме 11 (11q24.1-24.2) и имеет размер около 10 тпн, из ко-
торых 1.3 тпн составляют кодирующую часть, включающую в себя 15 экзонов. ПБГД существует в двух изоформах, одна из которых экспрессирует-ся только в эритроидных клетках, а другая является всетканевой [7]. Изоформы ПБГД кодируются двумя различными мРНК, транскрибирующимися с разных промоторов одного и того же гена, один из которых ("housekeeping") локализован в 5'-области гена, а другой (эритроидный) — на расстоянии около 3 тпн от него в интроне 1. Эритро-идная мРНК ПБГД начинается с экзона 2 и имеет инициирующий кодон в экзоне 3, тогда как не-эритроидная мРНК имеет инициирующий кодон в экзоне 1 и не содержит экзона 2, который удаляется из нее путем альтернативного сплайсинга [8].
Первые мутации в гене ПБГД были обнаружены в 1989 г. [9]. К настоящему времени в различных популяциях мира выявлено свыше 350 мутаций, приводящих к ОПП [10, Human Genome Mutation DataBase, Cardiff (HGMD)]. Большинство из них уникальны, т.е. обнаружены в единичных семьях, что говорит о высокой гетерогенности генетических дефектов, приводящих к ОПП. Тем не менее существуют мутации, которые широко распространены по всему миру (например, миссенс-мутация Arg173Trp), а также мутации, встречающиеся с достаточно высокой частотой в отдельных популяциях, как, например, делеция 669—698del, найденная только в Испании [11]. В первом случае речь идет о нарушениях, независимо возникающих в "горячих точках" мутаций (чаще всего это CG-динуклеоти-ды), второй случай является следствием "эффекта основателя". В целом очевидной корреляции между типом мутационного нарушения и клинической картиной развития заболевания не наблюдается. При наличии у разных пациентов одной и той же мутации течение болезни может быть как острым, так и ослабленным, с единичными или многократными приступами [12, 13]. Однако единого мнения по этому вопросу до сих пор нет, и отдельные исследователи полагают, что некоторые мутации все же могут вносить определенный вклад в клиническую экспрессию ОПП [14—16].
Все острые порфирии, имея доминантный характер наследования, характеризуются невысокой пенетрантностью (около 10%), свидетельствующей о том, что мутация в гене одного из ферментов системы биосинтеза гема является необходимым, но не достаточным условием клинического проявления болезни. Должны существовать какие-то дополнительные генетические факторы, предопределяющие патологический фенотип у гетерозиготных носителей мутантного гена. Интенсивные исследования в области молекулярной генетики острых порфирий ведутся во многих странах мира. С 2005 г. реализуется Европейский проект [17], направленный на развитие международного сотрудничества в исследовании и лечении порфирий (EPI — European Porphyria Initiative), частью которого явля-
ется вэб-сайт (http://www.porphyria-europe.org/). Многие авторы отмечают, однако, неполноценность современного медико-генетического консультирования острых порфирий из-за невозможности дифференцированного подхода к бессимптомным носителям заболевания (особенно, детям и подросткам) и выделения среди них каких-либо групп риска, обусловленной отсутствием информации о дополнительных генетических факторах, сонаследующихся с мутантными генами и принципиально влияющих на патогенез заболевания. Такие факторы в настоящее время обнаружены только для двух доминантно наследуемых порфирических нозоло-гий, не относящихся к острым, — ЭПП и ПКП [18]. Для ЭПП показана определяющая роль в формировании клинического фенотипа сонаследования му-тантного гена феррохелатазы с полиморфным алле-лем этого же гена дикого типа (полиморфизм T/C в позиции —48 интрона 3), в котором активирован криптический акцепторный сайт сплайсинга, генерирующий аберрантную лабильную мРНК [19, 20]. Для ПКП показано участие в патогенезе совместного наследования мутантных аллелей основного гена уропорфириногендекарбоксилазы и распространенного мутантного варианта C282Y гемохрома-тозного гена HFE [21], а также полиморфизма m4 гена CYP1A1 [22] и генотипа A/A по C/A-поли-морфизму в интроне 1 гена CYP1A2 [23].
В данной работе мы подводим промежуточные итоги молекулярно-генетического исследования ОПП в России, проводимого в ГНЦ РАМН, включающие успешный мутационный анализ гена ПБГД для 70 неродственных пациентов, семейную диагностику носительства, установление характера происхождения распространенных мутантных аллелей и проверку гипотезы об участии функционально неполноценных аллелей гена ПБГД дикого типа в патогенезе заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Идентификация мутаций. Мутации в гене ПБГД определяли у 70 неродственных больных с диагнозом ОПП. Дифференциальный диагноз ОПП устанавливали на основе сочетания характерных клинических признаков с увеличенным содержанием порфиринов и их предшественников в моче, нормальным содержанием общих порфиринов в кале и сниженной активностью ПБГД в эритроцитах [13].
Выделение ДНК и РНК. ДНК выделяли из ядерных клеток периферической крови после селективного лизиса эритроцитов 0.8%-ным раствором хлорида аммония по стандартной методике, включающей обработку додецилсульфатом натрия (0.5%) и протеиназой К (200 мкг/мл) в течение ночи при 37°С с последующей фенольной экстракцией.
Таблица 1. Праймерные системы, использованные для гаплотипирования гена ПБГД
SNP Сочетания праймеров и их структура Размер ПЦР-продукта, пн Рестрикционная эндонуклеаза
-64T/C pp 1 - ^(GAGTCAGACTGTAGGACGAC)/ pp1-2 (ATGGCAACCTGGGGCCAATC) 233 Mnll
2377A/C ppSNP1D (GACCTCCGTCTTAGACTGAA/ ppSNP1R (TACAGTCCTGCTCAGCCTCT) 376 AsuHPl
2479G/A То же То же MspR9I (Bstirn)
3581G/A pp3-1 (ACACTAGAAACAGAGGGGAC) / pp4-2 (ACGGGCTTTAGCTATAGGCA) 595 BsoMAI
3982C/T pp5-6(CCCCATCATGAATCGTAGCA)/ pp6-2(GCAAGAGACCTAGCATACTA) 345 AspLEI
7064C/A pp11-1 (GGAACTCCCATCTCACTGCC) / pp12-2 (CAGCTCTCCAAGTCCCCAGC) 523 Hinil
8578G/A pp3endD (GAGTTGGCGGGAAGATAGGA/ pp3endR (GGCTCTACTGTTAACTGAAGG) 211 Mnll
Тотальную РНК из ядерных клеток пер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.