научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦИАНОФАГОВ СЕМЕЙСТВА MYOVIRIDAE В ОЗЕРЕ ХУБСУГУЛ (МОНГОЛИЯ) Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦИАНОФАГОВ СЕМЕЙСТВА MYOVIRIDAE В ОЗЕРЕ ХУБСУГУЛ (МОНГОЛИЯ)»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 6, с. 1030-1034

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 578.811

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦИАНОФАГОВ СЕМЕЙСТВА Myoviridae В ОЗЕРЕ ХУБСУГУЛ (МОНГОЛИЯ)

© 2014 г. Т. В. Бутина1*, С. А. Потапов1, О. И. Белых1, В. С. Муханов2, О. А. Рылькова2, N. Damdinsuren3, B. Chojdash3

1Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск, 664033 Россия 2Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского, Севастополь, 299011 Россия 3National University of Mongolia, Ulaanbaatar, 14200 Mongolia Поступила в редакцию 14.05.2014 г. Принята к печати 25.06.2014 г.

Исследовано разнообразие цианомиовирусов семейства Myoviridae, обитающих в оз. Хубсугул, на основе анализа фрагментов генаg20. Показано, что последовательности этого гена цианомиовирусов разнообразны и сходны с соответствующими генами вирусов из оз. Байкал. Наличие близкородственных штаммов вирусов в этих водоемах определяется их географической близостью, прямой водной связью, а также сходством гидрохимических параметров этих озер.

Ключевые слова: генg20, генетическое разнообразие, цианофаги, семейство Myoviridae, озеро Хубсугул.

MOLECULAR-AND-GENETIC DIVERSITY OF CYANOPHAGES OF THE FAMILY Myoviridae IN LAKE HOVSGOL (MONGOLIA), by T. V. Butina1*, S. A. Potapov1, O. I. Belykh1, V. S. Mukhanov2, О. А. Rylkova2, N. Damdinsuren3, B. Chojdash3 (1Limnological Institute, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Irkutsk, 664033 Russia, *e-mail: tvbutina@mail.ru; 2Institute of Biology of the Southern Seas, Sevastopol, 299011 Russia); 3National University of Mongolia, Ulaanbaatar, 14200 Mongolia). Cyanophages of the family Myoviridae were studied in Lake Hovsgol based on the analysis of g20 gene fragments. The analysis revealed the diversity of g20 cyanomyovirus sequences in Lake Hovsgol. It was found a great similarity of genes from the Lake Hovsgol and Lake Baikal. Distribution of closely related virus strains in these water bodies is attributed to close geographical location, direct water connection and similar hydrochemical parameters of the lakes.

Keywords: gene g20, genetic diversity, cyanophages, family Myoviridae, Lake Hovsgol.

DOI: 10.7868/S0026898414060044

Вирусы — самые многочисленные биологические объекты на Земле, в водных экосистемах их концентрация достигает 108 частиц/мл [1]. Большинство водных вирусов являются бактериофагами, значительную их часть составляют цианофаги — вирусы, поражающие цианобактерии. Все известные цианофаги принадлежат к отряду Саи-ёоука^ (хвостатые бактериофаги), включающему семейства Шуоутйаг, Ройоутйаг и 81ркоу1т1йаг. Большая часть морских цианофагов (80%) относится к семейству Шуоутйаг (цианомиовирусы) [2, 3]. Они регулируют численность и разнообразие пикопланктонных цианобактерий — основных продуцентов органического вещества в морских и пресных водоемах [4].

Исследование разнообразия вирусов в природных популяциях представляет нелегкую задачу, поскольку универсальных для всех вирусов гене-

* Эл. почта: tvbutina@mail.ru

тических маркеров нет. Однако можно использовать олигонуклеотидные праймеры к некоторым консервативным генам — для выявления вирусов определенного семейства или рода. На основе гена g20, продукт которого у бактериофага Т4 отвечает за инициацию сборки головки фага, упаковку ДНК и связывание головки и хвостового отростка, сконструированы праймеры для идентификации цианофагов семейства Шуоутйаг в природных образцах [5, 6]. Благодаря использованию этого маркерного гена исследованы пространственные и сезонные изменения в составе цианофагов и обнаружены некоторые абиотические факторы, оказывающие влияние на формирование сообществ цианомиовирусов [3, 5—10]. Большая часть исследований посвящена морским экосистемам; пресноводные циано-фаги, особенно крупных малопродуктивных (олиго- и ультраолиготрофных) озер, остаются практически не изученными. Ранее исследова-

ние такого рода проведено нами на оз. Байкал. В этом озере обнаружены разнообразные и уникальные варианты генов g20; найдены также некоторые различия в сообществах цианомиовиру-сов, обитающих в трех котловинах озера [11].

Цель настоящей работы — исследовать на основе анализа гена g20 генетическое разнообразие ци-анофагов сем. Myoviridae в оз. Хубсугул. Это крупное ультраолиготрофное озеро имеет тектоническое происхождение, расположено на севере Монголии на высоте 1645 м над уровнем моря в Байкальской рифтовой зоне, на расстоянии 220 км от оз. Байкал. Озера связаны реками Эгийн-Гол и Селенга. Оз. Хубсугул имеет древнее происхождение (5—3 млн. лет) [12], его биота необычайно разнообразна, а антропогенное воздействие на него незначительно [13]. Озеро остается малоизученным; мол екулярно-генетические исследования вирусных сообществ в нем ранее не проводили.

Пробы воды отбирали в августе 2011 г. в пела-гиали северной части оз. Хубсугул на глубине 0, 5, 15, 25 и 50 м. Образцы воды (5 мл) отбирали в криопробирки и замораживали в жидком азоте для количественного анализа пикоцианобакте-рий, бактерио- и вириопланктона. Численность организмов определяли, используя проточный цитометр Cytomics FC 500 ("Beckman Coulter", США).

Вирусную фракцию выделяли с помощью центрифужных концентраторов Vivaspin 500 (30 кДа) после фильтрования проб воды (50 мл) последовательно через поликарбонатные фильтры (Milli-pore) с диаметром пор 1.2, 0.45 и 0.22 мкм. Образцы использовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) без предварительного выделения ДНК в присутствии праймеров к гену g20 (CPS1 и CPS4), предложенных ранее [5, 6]. Для ПЦР использовали реагенты "ИнтерЛабСервис" (Россия), условия реакции соответствовали рекомендованным [7]. Из планктонных проб оз. Хубсугул амплифицированы фрагменты гена g20 с помощью этих праймеров, причем ПЦР проходила даже без предварительного обогащения проб путем концентрирования. Ампликоны анализировали, как описано ранее [11, 14]. Клонированные фрагменты секвенировали в ЦКП "Геномика" (Новосибирск). Нуклеотидные последовательности фрагментов гена g20 выравнивали и редактировали при помощи программы Bio Edit (v7.0.5) [15]. Идентичные последовательности исключали из дальнейшего анализа.

Для поиска ближайших гомологов по банку данных NCBI применяли программу BLAST (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov). Филогенетическое древо конструировали на основе выведенных из последовательностей генов аминокислотных последовательностей, используя Байесовский анализ (программа MrBayes v3.2.1 [16]); в анализ

включали также опубликованные последовательности генов других вирусов из морей, пресных и опресненных (эстуариев) водоемов, перечисленные в таблице. Создавали 5 млн. генераций цепей Маркова (МСМС), отбирая каждое двухсотое генерированное дерево; первые 12500 деревьев исключали из анализа. В качестве внешней группы использовали последовательность белка §20 бактериофага Т4 (Х16055).

Общая численность пикоцианобактерий в слое 0—50 м исследуемого озера, в среднем, составляет 39 тыс. клеток/мл, бактериопланктона — 180 тыс. клеток/мл, свободных вирусных частиц — 170 тыс. частиц/мл. В целом, как показано ранее [17—19], численность пикоцианобактерий, бактерий и вирусов в озере невелика, как и в других ультра-олиготрофных водоемах [20].

Определены последовательности 32 фрагментов гена g20 длиной 470—476 п.н. (депонированы в GenBank, Ю776605-Ю776623). Их сходство варьирует в пределах 61.1—99.7%. По данным BLAST-анализа фрагменты гена g20 имеют 78—88% сходства с последовательностями культивированных и некультивированных цианофагов семейства Муоу1Мав. Максимальное сходство наблюдается при сравнении определенных нами генов с генами некультивированных бактериофагов пресных озер Байкал [11], Бурже (Франция) [8] и Эри (США) [10]. Идентичных определенным нами последовательностям генов g20 в GenBank не зафиксировано, т.е. в оз. Хубсугул обнаружены уникальные гены g20 бактериофагов семейства Муоу1Мав.

Результаты филогенетического анализа представлены на рисунке. Не вызывает сомнения близкое родство большинства фрагментов белка §20 из озер Хубсугул и Байкал. Последовательности из оз. Хубсугул формируют четыре кластера, три из которых образуют монофилетические группы с фрагментами из оз. Байкал. Очевидно, близкое географическое расположение, прямая водная связь через реки и сходство гидрохимических параметров обусловили распространение в этих водоемах близкородственных штаммов циа-номиовирусов. Ранее анализ генетического разнообразия Т4-подобных вирусов (на основе генов g23) в пресных озерах, включая оз. Байкал, выявил тенденцию, согласно которой продуктивность водоемов влияет на формирование вирусных сообществ [21]. Эти данные свидетельствуют о том, что факторы среды, определяющие трофический статус водоемов, оказывают более сильное влияние на структуру вирусных сообществ, чем их географическое положение.

Два кластера последовательностей из оз. Хуб-сугул и оз. Байкал и два отдельных байкальских кластера принадлежат кладе CSP [9], в состав которой входят все культивированные цианофаги Synechococcus и Prochlorococcus 8рр. из различных

Последовательности гена g20 цианофагов из базы данных GenBank, использованные для филогенетического анализа

GenBank Acc. No. Название цианофага Место отбора проб/Условное обозначение Ссылка

Культивированные цианофаги*

AF016384-AF016386 S-PM2 S-WHM1 S-BnM1 пролив Ла-Манш Атлантический океан, порт Вуд Хол, США Северное море, порт Берген, Норвегия [5]

AY027974-AY027984 27A,31B, 32A, 44A S-PWM1, P6 P12, P77, P81, P79 P17 Саргассово море Мексиканский зал. р. Олтамаха, р. Сатилла (эстуарии), США Желтое море, Китай [6]

AY259244—AY259283 S-RIM1-S-RIM40 Атлантический океан, побережье штата Род-Айленд, США [3]

AY705145, AY705146 S-PWM3 S-PWM4 Мексиканский залив [9]

EU715778-EU715813 P-RSM.., Syn.., S-(P-)SSM.., S-(P-)ShM.., S-SM.. Красное море, Атлантический океан: Гольфстрим, Саргассово море, Бермудские и Багамские острова [22]

Некультивированные цианофаги

AY426128—AY426174 оз. Бурже, Франция/LB [8]

DQ318388-DQ318432 оз. Эри, США/LGL [10]

AY027938—AY027973 Атлантический океан, Гольфстр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком