»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1999, том 25, № 11, с. 868-880
УДК 541.(64+127+183):577.151:542..952
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ
© 1999 г. В. П. Зубов", А. Е. Иванов, Л. С. Жигис, Е. М. Рапопорт, Е. А. Марквичева, Ю. В. Лукин, С. Ю. Зайцев
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 29.04.99 г. Принята к печати 06.07.99 г.
Настоящий обзор посвящен достижениям в области новых полимерных материалов биомедицинского назначения, разработанных в лаборатории "Полимеры для биологии" ИБХ РАН. Сюда относятся: композиционные твердокаркасные сорбенты для биохроматографии, полимерные дисперсии для иммуноанализа, полимерные гидрогели для иммобилизации ферментов и клеток, полимерные ультратонкие пленки как модели биомембран и материалы биосенсоров. Рассмотрены свойства и особенности новых материалов и моделей.
Ключевые слова: полимеры, привитые фазы адсорбированные и хемосорбированные; биосорбенты композиционные; иммобилизация ферментов и клеток; реагенты для иммуноанализа. мембраны полимерные ориентированные; биосенсоры.
ВВЕДЕНИЕ
Современный прогресс в биотехнологии, развитии биоаналитических и терапевтических методов во многом обязан использованию новых полимерных носителей (сорбенты, микроносители, гели, гранулы, мембраны, пленки и др.), функционирующих в контакте с растворами биополимеров, биологическими жидкостями, клетками и культурами тканей. Указанные материалы весьма разнообразны по своим физическим и химическим свойствам, однако их объединяет между собой не только назначение, но и способность специфически взаимодействовать с биологическими молекулами и частицами при минимуме неспецифических взаимодействий, денатурации и цито-токсичности. Создание подобных материалов можно рассматривать как новую область науки и техники - биологическое материаловедение, лежащую на стыке физико-химической биологии и химии полимеров. Практическая реализация фундаментальных научных достижений в виде конкретных биотехнологических процессов, лабора-
Сокращения: МАЬ - моноклональные антитела; PNPA -поли-и-нитрофенилакрилат; СТАВ - цетилтриметиламмо-нийбромид; А-ПС - полисахарид стрептококков группы А; ИФА - иммуноферментный анализ; МА16 - полимеризу-Ю1цийся аналог СТАВ; МС-ПА - макропористое стекло с хемосорбированным PNPA; ПАЛМ - поверхностно-активные и липидоподобные мономеры; ПАМ - полиакролеи-новые микросферы; ПВК - поли-Д'-винилкапролактам; ПХ - пероксидаза хрена; РЛАМ - реакция латексной агглютинации в микропланшете.
# Автор для переписки (тел.: (095) 336-06-00; факс: (095) 335-10-11; e-mail: zubov@ibch.siobc.ras.ru).
торных технологий, биоаналитических и терапевтических систем оказывается затруднительной, а порой и невозможной без создания специальных материалов (матриц), взаимодействующих с биологическими объектами и обеспечивающих направленное достижение поставленной задачи. Это позволяет считать биологическое материаловедение важной составной частью современной биологии.
Созданная в институте по инициативе академика Ю.А. Овчинникова 20 лет назад лаборатория "Полимеры для биологии" проводит исследования в некоторых областях биологического материаловедения с целью разработки соответствующих функциональных полимерных матриц. В настоящем кратком обзоре приводятся некоторые из полученных в последнее время результатов. Будут рассмотрены полимерсодержащие матрицы для процессов биосепарации (сорбенты для жидкостной хроматографии), биоаналитические системы (полимерные дисперсии для иммуноанализа), полимерные гранулы на основе обратимых термо-осаждаемых полимеров для капсулирования животных клеток и нестабильных ферментов и модели мембран на основе полимеризующихся липидов. Несмотря на различие химических и биологических объектов, рассматриваемых в предлагаемых примерах, эти исследования объединяет общий подход, основанный на оптимизации на молекулярном и надмолекулярном уровне взаимодействия биологических компонентов с синтетическими полимерными матрицами.
1. АДСОРБИРОВАННЫЕ И ХЕМОСОРБИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРЫ КАК ПРИВИТЫЕ ФАЗЫ БИОСОРБЕНТОВ
Адсорбция и хемосорбция полимеров представляет собой весьма эффективный метод направленного изменения поверхностных свойств различных твердых носителей. Одной из важных областей применения этих процессов является синтез хроматографических и иных сорбентов с заданной химической функциональностью и свойствами. Особое место среди этих материалов занимают биосорбенты, т.е. сорбенты, предназначенные для работы в контакте с растворами белков, нуклеиновых кислот, других веществ природного происхождения, а также с надмолекулярными частицами, такими, как вирусы, фаги, клеточные органеллы и др.
Основные направления исследований и результаты, достигнутые в этой области, были подробно обсуждены нами в предшествующих обзорах [1,2]. Цель настоящего раздела работы - рассмотрение взаимосвязи между фундаментальными аспектами адсорбции полимеров и практическими особенностями использования их поверхностных слоев в качестве привитых фаз биосорбентов.
Адсорбция полимеров, протекающая путем обратимого взаимодействия их сегментов с поверхностью носителя, уже много лет изучается как теоретически, так и экспериментально [3-5]. Адсорбция посредством необратимого связывания сегментов макромолекул изучена гораздо меньше [6-8]. Воспользуемся теоретической оценкой особенностей строения адсорбционных слоев полимеров, данной в работах [6, 7]. Одна из основных характеристик строения адсорбционного слоя - функция распределения сегментов макромолекул по нормали к поверхности носителя. На рис. 1 представлены примеры соответствующих функций распределения для полимеров, взаимодействующих с поверхностью различным образом: 7 - сильное притяжение при обратимом связывании сегментов (например, адсорбция полиэлектролита из солевого раствора), 2 - сильное притяжение при необратимом связывании (то же, из бессолевого раствора), 3 - слабое притяжение при необратимом связывании (хемосорбция незаряженного полимера). Из представленных зависимостей видно, что распределение сегментов в случае обратимого связывания является экспоненциально убывающим (подробно эта задача рассмотрена в работе [5]). В то же время для необратимой сорбции полимеров характерно образование более протяженных сегментов, экспонированных в раствор. Это могут быть как концевые фрагменты, хвосты, так и петли полимерных цепей. Физически адсорбированные полиэлектролиты располагаются существенно ближе к по-
верхности носителя и взаимодействуют с ним большим числом своих сегментов (кривые 7, 2).
Указанные особенности адсорбции полимеров имеют многообразные практические следствия. Например, для решения одной из основных проблем синтеза биосорбентов - устранения неспецифической сорбции белков - целесообразно использовать хемосорбцию нейтральных макромолекул с последующим блокированием их активных функциональных групп. Таким образом формируется полимерная фаза, не имеющая четкой границы с контактирующим раствором, а, следовательно, и большого избытка свободной энергии, локализованного на этой границе (кривая 3). Более того, протяженные петли и хвосты привитой фазы обладают значительным исключенным объемом и препятствуют адсорбции белков за счет эффектов взаимного отталкивания [9].
Изложенные теоретические представления были подтверждены многочисленными работами по синтезу биосорбентов путем хемосорбции полимеров (см. список литературы в обзорах [1, 2]), в том числе и авторами настоящей статьи. Путем хемосорбции сополимеров УУ-винилпирролидона и акрилоилхлорида (1 : 1) на реакционноспособ-ных производных макропористых стекол и сили-кагелей были получены сорбенты для фракционирования ряда вирусов человека и животных методом эксклюзионной хроматографии [10-12], а также биоаффинные сорбенты для выделения вирусных антигенов [13] и белков системы комплемента человека [14]. Хроматографические выходы разделяемых белков и частиц близки к количественным, а их антигенные и иммуноген-ные активности сохранялись практически полностью [10, 13].
10 20 д-
Рис. 1. Адсорбция макромолекул на поверхности носителя. Зависимость логарифма плотности сегментов (р(х)) от расстояния до поверхности носителя (х), рассчитанное для обратимой (/) и необратимой (2, 3) адсорбции макромолекул, в случае сильного (1,2) и слабого (3) притяжения сегментов (по данным работы [6]).
1-4 " У2- с
Рис. 2. Зависимость первых статистических моментов Ц] хроматограмм п-нитроанилина (7), сывороточного альбумина (2), суспензии вируса гриппа (_?) от времени элюции на колонке. Колонка 1 х 12 см, сорбент-макропористое стекло с привитой фазой на основе сополимера Д'-винилпирролидона и Д'-(2-гидрокси-этил)акриламида (1 : 1), (0 - время ввода пробы, ^ -длина колонки, (![ рассчитывали как указано в работе [16]. ? - время элюции. Элюент - 0.05 М фосфат калия, рН 7.0; температура: 10 (•), 25 (О), 37°С (□).
^280
Время, ч
Рис. 3. Кинетика сорбции моноклональных антител на биоаффинных сорбентах с иммобилизованным гаптеном Юа1а1-3 (Риса1-2)-0а1р1-0(СН2)3К'Н2, ами-нопропилгликозид трисахарида с групповой специфичностью крови В) в статистическом режиме. Носители: АГП-Ое1 10 (У); ВгСЫ-сефароза 4В (2); МС-ПА (_?); МС-ПА, не содержащее гаптен (4). Условия сорбции описаны в работе [20].
Структура полученных привитых фаз во многом соответствует предсказаниям теории и характеризуется малой долей сегментов сополимера в контакте с поверхностью (0.08 при молекулярной массе 35000) и значительной долей сегментов в виде протяженных петель и хвостов [13] (см. кривую 3 на рис. 1). Необратимая адсорбция белков на сорбентах этого типа пренебрежимо мала (по крайней мере в несколько раз меньше, чем на глицидилсилильных производных неорганичес- !
ких носителей и в десятки раз меньше, чем на исходных пористых стеклах и силикагелях [13]). Как видно из рис. 2, элюция сывороточного альбумина, стандартного белка для тестирования биосорбентов, происходит в пределах полного объема колонки (прямая 2, тангенс угла наклона мень
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.