научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК У ЭУКАРИОТ Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК У ЭУКАРИОТ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 4, с. 389-401

^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ

РАДИОБИОЛОГИЯ

УДК 577.2.017.3:[539.1.04+535-31]

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК У ЭУКАРИОТ

© 2007 г. В. Г. Королев*

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина

Стабильность генома приоритетна для выживаемости и функционирования всех организмов. Дву-нитевые разрывы (ДНР) ДНК возникают спонтанно в ходе роста клеток или индуцируются в результате внешних воздействий. В ответ на каждый ДНР в клетке запускается ряд процессов, обеспечивающих репарацию повреждений ДНК, а следовательно, сохранение целостности генома и выживаемость. Для осуществления этих событий в клетках должен регулироваться тонкий баланс между потенциально конкурирующими путями репарации ДНР ДНК. Большинство данных, которые известны в настоящее время о репарации ДНР у эукариот, были получены на модели почкующихся дрожжей. В этом обзоре основное внимание будет уделено результатам, полученным именно на этом организме.

Двунитевые разрывы ДНК, репарация, рекомбинация, дрожжи.

Рекомбинация имеет фундаментальное значение для широкого круга биологических процессов, таких, как мейоз, стабильность вегетативных хромосом и их сегрегация, антигенные вариации и перестройки иммуноглобулиновых генов, поддержание числа копий и гомогенность в семействах повторяющихся генов, контроль экспрессии генов. Рекомбинация также играет роль в злокачественном перерождении клеток. Основная часть наших знаний о генетическом контроле рекомбинации была получена в исследованиях на микроорганизмах. Особая роль в этих исследованиях отводится грибам, так как клетки некоторых их видов имеют как митотический, так и мей-отический циклы. Среди эукариот наилучшим примером изученности рекомбинационных процессов являются почкующиеся дрожжи Saccharo-myces cerevisiae.

Двунитевые разрывы (ДНР) ДНК эффективно инициируют рекомбинационные процессы. В норме ДНР возникают с невысокой частотой в период репликации генома, однако при действии ионизирующей радиации, а также ряда химических агентов в ДНК клетки может возникать множество ДНР. Ряд метаболических процессов в клетках сопровождаются появлением ДНР, индуцированных ферментами. Таким образом, ДНР ДНК, индуцированные эндогенными ферментативными либо экзогенными факторами, инициируют процесс рекомбинации, приводящей к репарации повреждений. При этом репарационные и

* Адресат для корреспонденции: 188300 Гатчина, Ленинградская обл., Орлова роща, ПИЯФ, ОМРБ, тел.: (81371) 3-17-11; факс: (81371) 3-23-03; e-mail: lge@omrb.pnpi.spb.ru.

рекомбинационные события представляют собой сложный процесс, начинающийся с появления разрывов и заканчивающийся восстановлением непрерывной структуры ДНК.

Первая модель, описывающая рекомбинаци-онную репарацию ДНР ДНК, была опубликована в начале семидесятых годов прошлого века [1]. За прошедший период появилось множество модификаций этой модели репарации ДНР, которые приближались к реальной картине событий, происходящих в клетке [2]. Однако все модели, как правило, не учитывали тот факт, что в клетке ДНК сложно упакована, и доступ репарационных ферментов к ней ограничен. Структура хроматина должна изменяться для эффективного прохождения репарационных процессов. Но только в последние годы появились данные, приоткрывающие картину процессов модификации гистоно-вых белков, в результате чего ДНК становится доступной для репарации.

Репарация ДНР может происходить по нескольким механизмам: 1) гомологичной рекомбинации, которая разделяется на несколько самостоятельных ветвей: а) межсестринская; б) конверсионная; в) индуцированная разрывом ДНК репарация репликативной вилки; г) межхромосомная; 2) незаконную рекомбинацию, которая, в свою очередь, подразделяется на: а) соединение разорванной двунитевой ДНК конец в конец и б) соединение концов путем отжига процессиро-ванных однонитевых концов ДНР. Выбор механизма, по которому будет происходить репарация ДНР, зависит от нескольких факторов: стадии клеточного цикла, плоидности клетки, числа

Основные белковые комплексы, необходимые для репарации ДНР ДНК

Название комплекса Субъединицы комплекса Функция

MRX Rad50, Xrs2 Mre11(Rad58) Резекция концов ДНР ДНК

RPA Rfal, Rfa2, Rfa3 Связывание ОН* ДНК и чекпойнтных белков

MEC1/DDC2 Mec1, Mec1, Ddc2 Активация чекпойнта, перераспределение репарационных ферментов, фосфорилирование гистонов

Rad24/Rfc2-5 Rad24, Rfc2, Rfc3, Rfc4, Rfc5 Загрузка на конец ДНР белков, инициирующих чекпойнт

Mec3 Mec3, Rad17, Ddc1 Активация чекпойнта и репарационных процессов

Ku Ku70, Ku80 Связывание концов ДНР

Dnl Dn14, Lif1 и Po14 Объединение концов ДНР ДНК

Rad55/Rad57 Rad55, Rad57 Загрузка белка Rad51 на ОН ДНК

Rad51/Rad52 Rad51, Rad52 Образование D-петли

* OH ДНК - однонитевая ДНК.

ДНР ДНК, наличия достаточного количества дез-оксинуклеотидов.

ИНИЦИАЦИЯ РЕПАРАЦИИ ДНР ДНК

В свете современного понимания первых этапов репарационного процесса наиболее трудным для ответа остается вопрос о том, как клетка узнает о появлении в ее геноме ДНР. Этот вопрос в настоящее время не имеет однозначного ответа, но на основании имеющихся в литературе данных можно представить следующую цепь событий.

Концы ДНР являются субстратами для белковых комплексов Ku и MRX. Первый из этих комплексов обеспечивает инициацию незаконной рекомбинации (nongomologous end joining - NHEj), второй принимает участие в инициации обеих ветвей рекомбинационной репарации. Оба комплекса имеют сродство к концам ДНР и быстро с ними связываются. Кроме этих комплексов в инициации рекомбинационных событий принимают участие еще ряд белковых комплексов (таблица).

MRX комплекс состоит из продуктов трех генов MRE11 (RAD58), RAD50 и XRS2. Мутации в любом из этих генов приводят к плейотропному эффекту. Мутантные клетки приобретают чувствительность к ДНК-повреждающим агентам, геномную нестабильность, нарушение мейотической и ми-тотической рекомбинации, дефект в регуляции клеточного цикла и укороченные теломеры. Гаплоидные клетки мутантов xrs2, rad50 и rad58 столь же радиочувствительны, как и мутанты по генам RAD52, RAD51 и RAD54, а их кривые инактивации лишены радиорезистентного "хвоста" [3]. Эти результаты можно объяснить тем, что упомянутые выше гены абсолютно необходимы для межхроматидной рекомбинации.

Белок Rad58 образует гомодимер, который, в свою очередь, образует гетеромультимер с бел-

ками Rad50 и Xrs2 [4-6]. Кором этого комплекса является субкомплекс Rad50p-Rad58p, так как эти два белка эволюционно консервативны и имеют гомологов во многих эукариотических организмах, включая человека. Этот тройной комплекс проявляет эндонуклеазную и (3' —► 5')-экзо-нуклеазную активность в отношении одноните-вой (ОН) ДНК, а также (3' —- 5')-экзонуклеаз-ную активность на двунитевой (ДН) ДНК. При этом Rad58p играет одну из основных ролей в функционировании комплекса. Его молекулярная масса составляет ~80 kDa, и он может независимо взаимодействовать как с Xrs2p, так и с Rad50p [7-9]. Именно этому белку принадлежат ДНК-нуклеазная и ДНК-геликазная активности рассматриваемого комплекса. Rad50p имеет значительно большую молекулярную массу (~150 kDa) по сравнению с Rad58p и проявляет АТФ-за-висимое связывание с ДН ДНК [10], которое является критичным для функции белка. Связывание комплекса с АТФ приводит к конформацион-ным изменениям в Rad50p, что, в свою очередь, стимулирует нуклеазную активность белка Rad58. Белок Rad50 относится к семейству белков SMC, которые вовлечены в конденсацию хромосом и обеспечивают сцепление сестринских хро-матид в процессе репликации. Все эти белки, включая Rad50p, образуют антипараллельные го-модимеры с центральной шарнирной областью и двумя линейными плечами, на концах которых расположены АТФ-связывающие домены. Основной функцией Rad50p, по-видимому, является связывание с помощью линейных плеч концов ДНК и их удерживание для облегчения репарационных процессов. Xrs2p - наиболее загадочный компонент этого комплекса. Это связано с тем, что в отличие от двух других белков, которые эволюционно консервативны у всех эукариотических организмов, дрожжевой Xrs2p не имеет гомологов. Функциональную роль дрожжевого

Xrs2p у человека выполняет белок Nbsl. Эти два белка не похожи по первичной последовательности, но, как и другие функциональные аналоги, имеют домен FHA на их аминотерминальном конце. Домен FHA образует компактную глобулярную структуру и служит для связывания других белков после фосфорилирования одного из них [11]. Этот домен не играет роли в репарационной функции белка Xrs2, так как его делетирование не приводит к повышению радиочувствительности клетки [9]. В то же время для репарационной функции Xrs2p важна его связь с димером Rad58p, обеспечиваемая последними 100 аминокислотами на С-конце Xrs2p.

Радиочувствительность мутантов mre11A частично супрессируется мутациями в гене HDF1, который кодирует одну из субъединиц белкового комплекса Ku [4]. Более того, скорость 5' —► 3'-деградации концов ДНР снижается при делеции генов, кодирующих комплекс белков MRX, и увеличивается делетированием гена HDF1. Эти данные приводят к предположению о том, что Ku-белки конкурируют с (5' —» 3')-экзонуклеазой за концы ДНК [12]. Дальнейшие исследования показали, что комплекс MRX может процессировать концы ДНР в присутствии Ku-гетеродимера [13]. Однако последний ингибирует процессинг концов ДНР альтернативными экзонуклеазами в отсутствие комплекса MRX.

Скорость процессинга концов ДНР под действием комплекса MRX на первом этапе низкая, что приводит к образованию коротких OH хвостов. Эти OH участки покрываются белком RPA, который является гетеротримерным белком, связывающим OH ДНК. Белок RPA состоит из трех субъединиц Rpa1, Rpa2 и Rpa3 и играет существенную роль в репликации, рекомбинации и репарации [14]. RPA высоко консервативен в эволюции: его гомологи идентифицированы в клетках всех изученных эукариот. RPA эффективно связывается как с комплексом MRX, так и с чек-пойнтным комплексом MEC1/DDC2 [15]. При этом главную роль в связывании последнего с RPA играет субъеди

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком