УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 1, с. 13-24
УДК 577.152.277:633.71
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СИСТЕМНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ВИРУСНЫМ ИНФЕКЦИЯМ И СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ВИРУСОУСТОЙЧИВОСТИ ПУТЕМ ТРАНСГЕНЕЗА
© 2007 г. Е. Ä. Трифонова, Ä. В. Кочетов, В. К. Шумный
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Рассматриваются молекулярные механизмы системной устойчивости растений к вирусам как белок-опосредованные (SAR, ISR, IRH), так и РНК-опосредованные (генетический сайленсинг, индуцируемый вирусами растений). Обсуждаются основанные на этих механизмах способы повышения вирусоустойчивости растений путем трансгенеза.
Создание генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к таким быстро эволюционирующим патогенам, как вирусы, является одной из актуальных проблем молекулярной биологии и биотехнологии. Однако недостаточное понимание молекулярных механизмов системной устойчивости высших растений затрудняет разработку новых способов контроля вирусных болезней сельскохозяйственно-ценных растений.
Основным способом защиты высших растений от вирусных инфекций является механическая прочность покровных тканей и клеточных стенок растений. Этот механический барьер фактически непреодолим для большинства вирусов, и только физическое повреждение приводит к проникновению этих патогенов в межклеточное пространство и клетки растений, где запускаются защитные механизмы химической природы, формирующие иммунную систему растений [1]. В настоящее время защитные системы высших растений принято классифицировать на белок-опосредованные системы неспецифической приобретенной устойчивости и высокоспецифические системы, основанные на РНК-опосредованных механизмах [73].
НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ УСТОЙЧИВОСТИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ К ПАТОГЕНАМ
Системы неспецифической устойчивости подразделяют на:
- системную приобретенную устойчивость (systemic acquired resistance - SAR), индуцируемую патогенами;
- системную устойчивость, индуцируемую непатогенными почвенными бактериями (induced systemic resistance - ISR);
- устойчивость, индуцируемую насекомыми-фитофагами (induced resistance against herbivores -IRH).
Системная приобретенная устойчивость
Термин "systemic acquired resistance - SAR" впервые предложил Росс, который описал повышенную устойчивость верхних листьев растений табака, инфицированных вирусом табачной мозаики, в случае формирования некрозов на нижних листьях этих растений [80]. Изучение SAR на растениях огурца позволило выявить широкий спектр формируемой устойчивости, не зависящий от природы первоначального инфицирующего агента [56]. SAR была описана более чем для 30 видов как однодольных, так и двудольных растений [84].
Феномен SAR заключается в том, что заметно повышается устойчивость к самому широкому спектру грибных, бактериальных и вирусных патогенов в не затронутых первичной инфекцией частях растения, что и придает данному механизму системный характер. Основной вклад в формирование SAR вносит накопление специфических белков, связанных с патогенезом (pathogen-esis-related proteins, PR-proteins) [62]. Впервые PR-белки были идентифицированы как индуцируемая заражением белковая фракция в листовых экстрактах табака, инфицированного вирусом табачной мозаики с формированием некрозов [92]. Позднее показали, что растительный фенольный метаболит салициловая кислота (salicylic acid - SA) индуцирует синтез PR-белков и предобработка SA может также повысить устойчивость растений табака к вирусу табачной мозаики.
Салициловая кислота как индуктор SAR. Салициловая кислота играет важнейшую роль в сигнальных путях, приводящих к индукции SAR. После инфекции эндогенный уровень SA возраста-
Непатогенные Инфекция патогенами ризобактерии
Некрозы
Поранение/Поедание
насекомыми
Жасмоновая кислота
Этилен
Салициловая Жасмоновая кислота + Этилен
кислота Неизвестные сигнальные молекулы
Единый сигнальный белок —— NPR1 +
ШН
, SAR
Неизвестные PR-белки, индуцируемые соединения салициловой кислотой
Ингибиторы протеиназ Экстраклеточные нуклеазы PR-белки, не индуцируемые салициловой кислотой
Схема сигнальных путей в высших растениях, приводящих к формированию системного иммунного ответа [79, с изменениями].
ет, причем она обнаруживается во флоэме до формирования БАЯ [61]. Это означает, что БА начинает синтезироваться в ответ на инфицирование как локально, так и системно и таким образом продукция БА de novo в неинфицированных частях растения может вносить вклад в формирование системного иммунного ответа. Уровень системной устойчивости растений позитивно коррелирует с концентрацией БА, это показали для картофеля [20] и трансгенных растений араби-допсиса, экспрессирующих бактериальный ген салицилатсинтазы и поэтому имеющих повышенный уровень БА [60]. Ключевые эксперименты, доказывающие роль БА в формировании БАЯ-реакции у растений, проделаны с трансгенными растениями, экспрессирующими бактериальный ген nahG, кодирующий бактериальную салицилат-гидроксилазу G. Такие растения не способны накапливать БА и как следствие этого не способны к индуцированной экспрессии РЯ-белков [29]. Более того, растения, содержащие nahG-ген, значительно более чувствительны к бактериальным, грибковым и вирусным патогенам [25].
Важным компонентом всех трех известных на сегодняшний день систем индуцируемой устойчивости растений является белок КРЯ1. Растения Arabidopsis, мутантные по этому белку, не способны экспрессировать гены РЯ-белков (прг1 - поп-expressor of РЯ genes 1), а также имеют пониженную толерантность к токсичности БА одновременно с повышенным уровнем ее накопления, что приводит к выводу об участии КРЯ1 в процессах детоксикации и регуляции биосинтеза БА [28]. КРЯ1 также участвует в механизмах ограничения распространения патогена, формировании инду-
цируемой непатогенными бактериями системной устойчивости КЯ и регулирует взаимодействие БА-индуцируемого и жасмонат-индуцируемого путей формирования устойчивости [27]. Таким образом, с учетом КРЯ1 создана общая схема сигнальных путей высших растений, приводящих к формированию неспецифической устойчивости, которая приведена на рисунке.
PR-бeлкu. РЯ-белками называются белки растений, синтез которых индуцируется в патологических или сходных с патологическими стрессовых ситуациях [93]. Хотя очевидно, что функции этих белков должны быть связаны с защитными реакциями растений, идентифицированы они были исключительно благодаря накоплению в инфицированных растениях, а не антипатогенной активности. В настоящее время РЯ-белки классифицируют на 14 групп [94]. РЯ-белки различных групп, а часто даже внутри одной группы, различаются по молекулярной массе, изоэлектриче-ским точкам и иммунологическим свойствам. Показано, что белки, сходные иммунологически и по аминокислотным последовательностям с РЯ-белками табака, индуцируются патогенами в различных растениях как однодольных, так и двудольных [63].
Ключом к пониманию биологической роли РЯ-белков стало определение биохимической активности белков групп РЯ-2 и РЯ-3. Оказалось, что РЯ-2-белки имеют эндо-^-1,3-глюканазную активность [45], а РЯ-3-белки (как впрочем и РЯ-4, РЯ-8 и РЯ-11) являются эндохитиназами [50]. Поскольку клеточные стенки большинства грибов содержат 1,3-^-глюканы или хитин, взаимодействие грибных патогенов с хитиназами и в-1,3-
глюканазами может приводить к гидролизу клеточной стенки, причем фрагменты гидролиза будут содержать олигосахариды, которые являются элиситорами и стимулируют защитные системы растений, включая ферменты фенилпропаноид-ного пути и PR-белки. Показано, что очищенные хитиназы и ß-1,3-глюканазы ингибируют рост различных грибных патогенов, особенно при одновременном применении [59]. Очищенные PR-1 и PR-5 также ингибируют рост некоторых грибов [79]. PR-5-белки, которые называют тауматин-подобными белками (TLPs, тауматин - белок с интенсивным сладким вкусом из Thaumatococcus danielli, с которым PR-5-белки имеют большое сходство по последовательности аминокислот) вызывают вытекание цитоплазмы грибов и разрывы гифов, а очищенный PR-1-белок табака и томатов избирательно ингибирует рост оомице-тов [98]. Белки группы PR-6 являются ингибиторами протеиназ, предположительно нацеленными на микробные протеиназы и протеазы насекомых [33]. PR-7-белки - эндопротеазы [97], PR-9-белки - лигнин-формирующие пероксидазы [77]. PR-10-белок, выделенный из горького перца (Capsicum annuum), как оказалось, является функционально активной рибонуклеазой, участвующей в противовирусной защите растений [70]. Позднее классификацию PR-белков расширили и включили другие индуцируемые белки, такие как дефензины (PR-12), тионины (PR-13) и белки ли-пидного транспорта PR-14 [94].
Широкий спектр гидролазных и ингибиторных активностей, зафиксированных у PR-белков, находится в соответствии с приписываемой им ролью в формировании SAR у растений. Считается, что, во-первых, PR-белки активно гидролизуют компоненты патогенов, а во-вторых, вносят вклад в общую интоксикацию окружающей питательной среды. Однако из-за того, что большинство PR-белков кодируется, возможно, более чем одним геном и разные PR-белки действуют совместно, еще не получено прямых доказательств, что инактивация какого-либо специфичного PR-бел-ка приводит к повышению чувствительности к патогенам или насекомым.
Использование генов PR-белков в генетической инженерии. С развитием методов генетической инженерии гены PR-белков стали использоваться для трансформации растений с целью придания устойчивости к патогенам и насекомым-фитофагам. Наиболее "востребованными" в подобных экспериментах оказались гены хитиназ и ß-1,3-глюканаз, для которых доказали антигрибковую активность in vitro. Показано, что трансгенные растения табака с высоким уровнем экспрессии гена хитиназы фасоли более устойчивы к инфекции Rhizoctonia solani, что выражалось в задержке развития симптомов болезни [15]. В то же время высокая экспрессия собственного гена хи-
тиназы в трансгенном табаке не оказывает существенного влияния на устойчивость к Cercospora nicotianae [66]. Трансгенный табак, экспрессиру-ющий собственный PR-1a ген, ок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.