УДК 571.27
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ОСОБЫХ АНТИТЕЛ Camelus bactrianus, СОСТОЯЩИХ ТОЛЬКО ИЗ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ
© 2014 С.В. Тиллиб1*, А.С. Вятчанин1, С. Муилдерманс2
1 Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 34/5; факс: +7(499)135-4105, электронная почта: tillib@genebiology.ru
2 Laboratorium voor Cellulaire en Moleculaire Immunologie, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1050 Brussel, Belgium
Поступила в редакцию 30.08.14
Впервые детально изучены структурные особенности IgG, содержащихся в сыворотке крови двугорбого верблюда С. bactrianus, представителя семейства Camelidae, в сравнении с IgG других млекопитающих и, в первую очередь, с IgG других представителей того же семейства Camelidae. Последовательности антиген-связывающих доменов и шарнирных участков различных выявленных подклассов IgG были сопоставлены с соответствующими последовательностями антител одногорбого верблюда C. dromedarius. Обнаружено, что неканонические антитела HCAb, состоящие из димера укороченной тяжелой цепи и не содержащие легких цепей, являются мажорным подклассом IgG в сыворотке крови С. bactrianus. Антиген-связывающие домены этих особых антител, несмотря на некоторые минорные отличия, обладают принципиально теми же уникальными особенностями, что и аналогичные домены антител одногорбого верблюда или ламы. Эти структурные особенности принципиально важны для разработки эффективной технологии селекции одно-доменных антител, базирующихся на фаговом дисплее. Из полученных данных следует, что С. bactrianus является очень подходящим животным для того, чтобы индуцировать иммунный ответ, который служит в качестве источника для идентификации антиген-специфических VHH, отбираемых с помощью фагового дисплея.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антитело, IgG; вариабельный домен, однодоменное антитело.
Классические антитела млекопитающих (иммуноглобулины класса G, IgG) состоят из двух идентичных тяжелых цепей (Н-цепей) и двух идентичных легких цепей (L-цепей), соединенных друг с другом дисульфидными связями. У представителей семейства Camelidae (и у некоторых представителей хрящевых рыб) помимо таких классических антител в крови присутствует значительное количество весьма необычных IgG-антител упрощенной структуры, состоящих из гомодимера укороченных Н-це-пей при полном отсутствии L-цепей [1—3]. Эти необычные антитела, названные HCAb (Heavy-chain antibody), образуются в ходе V-D-J реком-
бинационных перестроек и соединения с соответствующими константными (Су) генами. Тяжелая (Н) цепь в случае HCAb состоит из трех глобулярных доменов вместо обычных четырех, при этом два константных домена высокогомологичны СН2-СН3 Fc-доменам классических антител [4, 5]. Домен, соответствующий СН1-домену классических антител отсутствует у HCAb, в результате чего антиген-связывающий фрагмент классического антитела, Fab, редуцирован до одиночного вариабельного домена (variable domain of the Н-chain of HCAb), который принято обозначать как VHH (а также Nanobody®, однодоменное антитело или нано-
Принятые сокращения: VH и VL — вариабельный (V) домен тяжелой (Н) и легкой (L) цепи иммуноглобулина; CH и CL — константный (C) домен соответственно тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина; HCAb (Heavy-chain antibody) необычный тип IgG-антитела упрощенной структуры, состоящей из гомодимера укороченных Н-цепей при полном отсутствии L-цепей; VHH — вариабельный домен HCAb (variable domain of the Н-chain of HCAb) представляет собой полнофункциональный антиген-связывающий фрагмент этого неканонического антитела; Fc (Fragment crystallizable) — фрагмент антитела, состоящий из константных доменов (СН2 и СН3); CDR (complementarity determining regions) — определяющий комплементарность гипервариабельный участок вариабельного домена антитела; ДТТ — дитиотреитол. * Адресат для корреспонденции.
антитело). Этот вариабельный домен, VHH, адаптирован для связывания соответствующего антигена при отсутствии вариабельного домена легкой цепи (VL) [6—9]. Уже многократно было продемонстрировано, что VHH, клонированный и экспрессированный в бактериях, является удобной мономерной однодоменной анти-ген-связывающей молекулой [10]. В случае HCAb иммунный ответ индуцируется в результате обычного протокола иммунизации животного. HCAb-антитела легко очищаются из сыворотки крови иммунизированного животного, и их антиген-связывающие фрагменты взаимодействуют с теми участками антигена-мишени, которые, по-видимому, нередко являются «менее антигенными» для антител классической структуры. Следствием того, что антиген-связы-вающий участок HCAb состоит всего из одного домена, VHH, явилось создание новой высокоэффективной технологии клонирования кДНК-последовательностей, кодирующих весь VHH-ре-пертуар иммунизированного животного (обычно ламы или одногорбого верблюда, Camelus dromedarius, также называемого дромадером или дромедаром) и последующей селекции клонов VHH, специфически связывающих заданные целевые антигены. Ряд уникальных особенностей наноантител, выгодно отличающих их от классических антител и их производных, предполагают большой потенциал использования в иммунобиотехнологии и медицине [3, 11].
Примерно 10 лет назад мы решили создать улучшенную платформу для генерирования VHH (наноантител) против различных антигенов для широкого спектра научных и прикладных задач. В России наиболее доступным и подходящим (в частности, для условий холодной зимы) экспериментальным животным семейства Верблюдовых оказался двугорбый верблюд, Camelus bactrianus (бактриан), обитатель степей и пустынь Центральной Азии, Казахстана, Монголии и Северного Китая. Эти верблюды в зимнее время имеют густую длинную шерсть, что позволяет им выдерживать очень низкие температуры (до —40°). Летом же они сбрасывают шерсть и вполне могут переносить сильную жару. C. dromedaries (в отличие от С. bactrianus), имеет один горб, обитает в Северной и Восточной Африке и даже в зимнее время имеет существенно более короткую шерсть, что не позволяет ему переносить те низкие температуры (даже такие, которые наблюдаются в Подмосковье), которые легко переносит бактриан. До нашей работы и C. dromedarius, и ламы успешно использовали для генерирования VHH, при этом особенности структуры их антител и последовательности VHH были довольно хорошо изучены. В
то же время С. bactrianus был новым и мало изученным животным в этом отношении. Целью настоящего исследования было изучение структурных особенностей ^О, содержащихся в сыворотке крови С. bactrianus, определение последовательностей ИСЛЬ-антител и сравнение полученных данных с таковыми для других Верб-людовых (в первую очередь для C. dromedarius).
Получены новые данные, демонстрирующие, несмотря на некоторые минорные различия, принципиальную схожесть выявляемых подклассов ^О и их последовательностей для всех упомянутых Верблюдовых. Тем самым, С. ЬасМапш является перспективным источником для технологии генерирования однодоменных антител, что также подтверждают результаты других наших работ по генерированию различных наноантител [12—16].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Взятие крови у двугорбого верблюда. Самец Came lus bactrianus в возрасте одного года был приобретен у Филиала московского зоопарка, затем его содержали на научно-экспериментальной базе «Черноголовка» Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН. Кровь для экспериментов брали из яремной вены.
Другие контрольные сыворотки крови (одногорбого верблюда C. dromedarius, ламы Lama glama, альпаки Vicugna pacos) были получены от компании «Gentaur» (Бельгия) или взяты у мышей C57B1/6 и здорового донора.
Фракционирование IgG на белок A- и белок G-сефарозе. Фракционирование IgG из сывороток C. bactrianus и других Верблюдовых проводили согласно процедуре, описанной ранее Хамерс-Кастерман и др. [1]. Сыворотку пропускали через колонку с белок G-сефарозой, после чего колонку промывали 20 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,0. IgG3 элюировали в растворе, содержащем pH 3,8, 0,15 M NaCl и 0,58%-ную уксусную кислоту. Затем IgG1 элюировали с колонки в 0,1М глицине-HCl, pH 2,7. Фракцию сывороточных белков, не связавшихся с белок G-сефарозой, наносили на колонку с белок А-сефарозой. IgG2a и IgG2b/IgG2c элюировали в растворе с pH3,5, содержащем 0,15 M NaC1 и 0,58%-ную уксусную кислоту. Фракции с элюи-рованными белками нейтрализовали, добавляя 1 M Tris-HCl, pH 9,0.
Суммарную фракцию IgG выделяли на комбинированной белок А-/белок G-сефарозе. Для уравновешивания колонки разведения наносимой на колонку сыворотки и последующей промывки колонки использовали стандартный фос-
фатно-солевой буферный раствор (PBS). Связавшиеся IgG элюировали в 0,1 М глицине-HCl, pH 2,7 и нейтрализовали, добавляя 1 M Tris-HCl, pH 9,0.
Электрофорез белков [17] проводили либо в «нативных» условиях (без добавления дитиотри-этола (ДТТ), при этом сохраняется цельность антитела), либо в восстанавливающих условиях, при которых в результате разрушения дисуль-фидных связей цепи иммуноглобулинов разделяются и движутся согласно их массе.
Клонирование и определение первичной структуры VH/VHH-фрагментов. Лимфоцитарно-мо-ноцитарную фракцию клеток крови получали путем наслаивания разбавленной в два раза (в PBS с 1 мМ ЭДТА) крови, взятой из двугорбого верблюда до его иммунизации, на ступеньку раствора с плотностью 1,077 г/см3 на основе фи-колла и диатризоата натрия, «Histopaque» («Sigma-Aldrich», США), и последующего центрифугирования при 800 х g в течение 20 мин на настольной центрифуге («Eppendorf», США) при комнатной температуре. РНК из клеток крови выделяли, используя TRIzol Reagent («Invitrogen», США). Поли(А)+РНК (мРНК) очищали на колонке с олиго^Т)-целлюлозой («Sigma-Aldrich»). Полученную мРНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы Superscript II RNaseH- («Invitrogen») и праймера oligo(dT)18. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, используя в качестве матрицы кДНК, а в качестве праймеров — олигонукле-отиды, комплементарные высококонсервативным участкам мРНК IgG: прямой праймер CALL001 (5'-gtcctggctgctcttctacaagg-3') соответствует последовательно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.