БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1997, том 23, № 10, с. 800-804
УДК 577.152.271.083.3
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К а-СУБЪЕДИНИЦЕ ГИПОТЕТИЧЕСКОЙ Н+,К -АТР-АЗЫ ЧЕЛОВЕКА,
КОДИРУЕМОЙ ГЕНОМ atplall
© 1997 г. Т. В. Корнеенко, Н. Б, Пестов, М. В. Егоров, М. В. Иванова, М. Б. Костина, М. И. Шахпаронов*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 02.12.96 г. Принята к печати 25.03.97 г.
N-Концевой фрагмент белка АТР1 ALI - предполагаемой каталитической субъединицы уабаинчув-ствительной Н+,К+-АТР-азы человека - синтезирован н Е. coli в виде двух рекомбинатнык белков: фрагмента SerI4-I!e104 и этого же фрагмента, содержащего в N-концевой области последовательность His6. С использованием очищенного металлоаффинной хроматографией белка в качестве антигена созданы две гибридомные линии, продуцирующие антитела класса JgM. Показано, что эти моноклональные антитела специфически распознают не только исходный антиген, ко и полнораз-мерный рекомбинантный белок ATP] ALI и не реагируют с Ыа+,К+-АТР-азой.
Ключевые слова: X*,Л' +-АТР-аза, ATPIAL1, гибридома, ИФА, моноклональные антитела, ПЦР, уа-иаин, эпитоп.
Среди различных ионтранспортирующих АТР-аз Р-типа (образующих фосфоршшрованный ин-термедиат в ходе рабочего цикла) можно выделить К+-зависимые АТР-азы (Х+,К+-АТР-азы, КФ 2.7.1). Эти мембранные белки являются гетеродимера-ми и состоят из каталитической а-субъеднницы и сильно гликозилированной (3-субъединицы. По своим структурным и функциональным свойствам внутри семейства К+-зависимых АТР-аз выделяют три группы белков: несколько изоформ Ка+,К+-АТР-азы, универсального компонента плазматических мембран высших эукариот [1], Н+,К+-АТР-азу слизистой желудка [2] и группу Н+,К+-АТР-аз так называемого нежелудочного типа [2].
Каталитические субьединипы Х+,К+-АТР-аз человека кодируются семейством родственных генов [3]. Функциональный статус одного из членов этого семейства - гена atpla.ll - долгое время оставался под вопросом. К настоящему времени определена полная нуклеотидпая последовательность кДНК а1р1а\1 [4], а также экзон-интронное строение гена [5].
Предполагаемый продукт гена а1р1а11, белок АТР1АЫ, последовательность которого выведена из структуры кДНК, состоит из 1039 а. о. и содержит структурные мотивы, характерные для Х+,К+-АТР-аз [4]. Результаты сравнительного
Сокращения: МА - моноклональные антитела; PBS - фос-фатно-солевой буфер, pH 7.4; PBST - PBS + твин-20 (10 г/л), TNF - фактор некроза опухолей. # Автор для переписки.
анализа последовательностей К+-завис1ШЫх АТР-аз позволили предположить, что белок, кодируемый геном atplall, относится к третьей группе семейства Х+,К+-АТР-аз, отличной от Na+,K+-ATP-a3 и Н+,К+-АТР-азы слизистой желудка, поскольку гомологичен с ними всего на 63-64% [4]. В третью группу Н\К+-АТР-аз включают также гипотетическую Н+,К+-АТР-азу дистального отдела толстого кишечника крысы [6J (86% гомологии с белком ATP1AL1) и Н+,К+-АТР-азу мочевого пузыря лягушки Huf о marinus (75% гомологии) [7].
Существование ß-субъединицы, ассоциированной с соответствующими (х-субъединицами К+-зависимых АТР-аз этой группы, подтверждено только для Н+,К+-АТР-азы лягушки [8]. Функциональная экспрессия гена atplall осуществлена совместно с геном ß-субъединицы желудочной Н+,К+-АТР-азы (gH.Kß) кролика в ооцитах Хепо-pus laevis [9] и в культивируемой клеточной линии млекопитающих НЕК 293 [10J. Данные по измерению связывания 86Rb+ (заменитель ионов К+) позволили сделать вывод, что комплекс ATPlALl-gH.Kß действительно является ^-зависимой АТР-азой, причем параметры его чувствительности и к уабаину (специфическому ингибитору Na+,K+-АТР-аз), и к SCH 28080 (специфическому ингибитору желудочной Н+,К+-АТР-азы) имели промежуточные значения между величинами, известными для Na+,K+-ATP-a3bi и желудочной Н+,К+-АТР-азы [9, 10]. На основании результатов по измерению внутриклеточного pH был сделан вывод, что исследуемый белок транс-
портирует также и протон [9, 10]. Однако стехиометрия транспорта К+ и Н+ была оценена как 10/1, а кроме того, поглощение Rb+ не стимулировалось острым понижением внутриклеточного pH [10]. Поэтому не исключается возможность транспорта этим насосом и других катионов (не только протона) в обмен на К+. Таким образом, в настоящее время принято считать, что белок ATP1AL1 является Ct-субъединицей уабаинчувствительной Н+,К+-АТР~азы.
На уровне мРНК установлено, что atplall экс-прессируется я коже, мозге и почках человека [4]. Работы по регуляции экспрессии мРНК Н+,К+-АТР-аз Р-типа в почках и толстом кишечнике при хронической гипокалиемии [11, 12] и в условиях изменения кортикостероидного статуса [12] свидетельствуют о важной физиологической роли Н+,К+-АТР-азы в поддержании гомеостаза ионов К+. Однако на сегодняшний день предполагаемая Н+,К+-АТР-аза - белковый продукт гена atplall -не обнаружена in vivo, не идентифицирована ее подлинная ß-субъединица, и физиологическая функция этого белка остается неясной.
Удобным инструментом детекции и выделения гипотетических белков, в том числе и ATP1AL1, могут стать специфические антитела. Основной ríeлыо пашей работы являлось получение МА, специфичных к гипотетическому белку ATP1AL1. В качестве антигена был выбран фрагмент Ser14—Не104 этого белка, который имеет низкий уровень гомологии с другими АТР-азами Р-типа [4]. Соответствующий участок кДНК амплифици-ровали с помощью ПЦР и клонировали по сайтам BamWlIHinálll вектора pQE30 под контроль модифицированного промотора фага Т5 113], в результате чего была получена конструкция рНЗО, обеспечивающая синтез целевого фрагмента белка с последовательностью His6 в N-концевой области. Затем вставка из плазмиды рНЗО была субклони-рована в вектор pQE 16 по сайтам ВатШ/НтдШ для получения белкового продукта без дополнительных остатков гистидина (конструкция pTL16/l). Выведенные N- и С-концевые аминокислотные последовательности полученных белков представлены в таблице. На рис. 1 показаны результаты электрофоретического анализа лизатов клеток Е. coli SG13009[pREP4], содержащих конструкции рНЗО и рТ1Л6/1, до и после индукции экспрессии, а также очищенного при помощи металлоаффин-ной хроматографии в денатурирующих условиях белкового продукта, кодируемого рНЗО.
Очищенный рекомбинантный белок имеет молекулярную массу около 14 кДа и р/ около 9.0, что соответствует теоретически рассчитанным величинам. Выход очищенного белка составил 20 мг на 1 л культуры, причем на электрофореграмме не заметно примесей бактериальных белков (на рис. 1 видна слабая полоса около 28 кДа, которая также принадлежит продукту экспрессии, поскольку в
Выведенные М- и С-концевые аминокислотные последовательности синтезированных рекомбинатных белков. Курсивом показаны аминокислотные остатки, кодируемые ДНК вектора
Плаз-мида Аминокислотная последовательность*
рНЗО pTL16/l MR GSHHHHHHGS S GTK DI V KTD(.... )TPEIÄbV MRGSSGTKD1V KTD(....)TPEI/TZJV
* Подчеркнут участок, последовательность которого подтверждена N-концевым секвенированием.
иммуноблоттинге реагирует с пол иклопальными антителами к фрагменту Serl4-Leu39 [101). Важно отметить, что после денатурации в 6 М гидрохлориде гуанидина и диализа против PBS белок не выпадает в осадок в отличие от многих других ре-комбинантных белков. Очищенный продукт, кодируемый плазмидой pTL16/l, 61.1л подвергнут N-концевому секвенированию, и полученная последовательность MRGSSGTKDI полностью совпадала с выведенной из ДНК.
Очищенный металлоаффинной хроматографией белок использовали в качестве антигена для иммунизации мышей и скрининга гибридом-пых клонов. Были получены две стабильные гиб-ридомные линии - 2Н11 и 1АЗ, продуцирующие антитела класса IgM, которые взаимодействуют с исходным антигеном.
Полученные МА реагируют в ИФА (рис. 2) с исходным антигеном, лизатом клеток Е, coli, содержащим белковый продукт, кодируемый pTL16/l, препаратом мембран клеток Sf-9, продуцирующих полноразмерный рекомбинантный белок ATP1AL1 , но не взаимодействуют с Na+,K+-ATP-азой, не реагируют с химерным белком, состоящим из TNF и фрагмента SerI4-Leu39 (плазмида pTHY230 [10]), и с контрольным белком, содержащим последовательность His6 в N-концевой области [14].
Таким образом, получены МА, специфически распознающие белок ATP1AL1. Специфичность этих МА и кроличьих поликлональных антител в целом примерно одинакова, однако МА имеют заметную кроссреактивность с неизвестным компонентом мембран клеток Sf-9 (рис. 2, Sf-9 - контроль).
Далее нами были предприняты попытки использовать полученные антитела для детекции белка в иммуноблоттинге. Однако только в случае продукта, кодируемого плазмидой рНЗО, можно было разглядеть слабую полоску и никогда -для белка без последовательности IIis6, кодируемого плазмидой pTL16/l (результаты не представлены). Поскольку в ИФА на полистирольных планшетах, напротив, лизат клеток с плазмидой pTL 16/1 дает существенно более сильный сигнал, чем лизат с плазмидой рНЗО (рис. 2), можно сде-
* Ю Чулиан, H.H. Модянов, А. Аскари (неопубликованные данные).
кДа 1 94 -67-
43 —
30 -
4 5 6
20
Рис. 1. Электрофореграмма в 15% ПЛЛГ лизатов клеток Е. coli SG13009[pREP4], содержащих плазми-ды рНЗО (4 - после индукции экспрессии, 5 - до индукции) и pTL16/l (6 - после индукции, 7 - до индукции), а также препарата рекомбинантного белка, кодируемого р] J30, очищенного металлоаффинной хроматографией (2, 3, с различной нагрузкой); 1 - стандарты молекулярной массы.
^492^450
1.0
0.8 0.6 0.4 0.2 0
□ 1A3 ш2Н11 ■пк AT
Tri—
I
3
Рис. 2. Результаты ИФА мопоклональных (1АЗ и 2Н11) и поликлональных антител (пкАТ) к фрагменту Ser'4-Leu39 [10] с использованием антигенов, иммобилизованных на полистирольных планшетах. В качестве антигенов использовали: 1 - Na+,K+-ATP-a3y, 2 - мембраны клеток -Sf-9, содержащие полноразмерный рекомбиналтный белок ATP1AL1; 3 - препарат мембран клеток Sf-9 (контроль); лизаты клеток Е. coli MG13009[pREP4], содержащие: 4 - контрольный белок с последовательностью His6 в N-концевой области
(продукт экспрессии фрагмента гена Са2+-АТР-азы плазма
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.