ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 1, с. 20-27
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
УДК 591
МОРФОДИНАМИКА ПЛАСТИНКИ КОНТАКТА В ХОДЕ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТА У СЦИФОИДНОЙ МЕДУЗЫ Aurelia aurita
(Cnidaria: Semaeostomae) © 2012 г. Л. С. Адонин12, О. И. Подгорная12, Т. Г. Шапошникова1
1 Кафедра цитологии и гистологии Санкт-Петербургского госуниверситета 2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург E-mail: leo.adonin@gmail.com Поступила в редакцию 09.04.2009 г.
Окончательный вариант получен 08.04.2011 г.
Структура, формирующаяся в области контакта ооцита с зачатковым эпителием при созревании ооцита сцифомедузы Aurelia aurita, названа пластинкой контакта. В представленной работе на све-тооптическом и ультраструктурном уровне прослежены последовательные этапы формирования пластинки контакта в процессе созревания ооцита. На начальных стадиях развития ооцита в его периферической цитоплазме отмечено появление гранул, которые скапливаются на полюсе, сохраняющем связь с зачатковым эпителием гонад. Среди этих гранул выявлены два типа — с гомогенным содержимым и рыхлым неоформленным материалом в виде толстых тяжей. Преобразование гранул 2 типа в более крупные структуры, а также объединение гранул 1 и 2 типов на поздних этапах развития ооцита, вероятно, и приводит к образованию видимой на парафиновых и полутонких срезах характерной структуры — пластинки контакта. Остается неясной точная локализация пластинки контакта в момент оплодотворения — внутри ооцита или вне его. Содержимое гранул и компоненты пластинки специфически связывают антитела (RA47) против мезоглеина, ZP-домен-содержащего белка мезоглеи A. aurita. Пластинка контакта, покрывающая только анимальный полюс ооцита, но обнаруженная по наличию ZP-доменных белков, может оказаться простейшей среди яйцевых оболочек типа Zona Pellucida.
Ключевые слова: Aurelia aurita, внеклеточный матрикс, мезоглеин, ZP-домен-содержащие белки.
Принятые сокращения: ZP — zona pellucida; BSA — бычий сывороточный альбумин, BCIP — 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, NBT — nitro blue tetrazolium, PVDF — polyvinyliden diftorid, GAR-AP — антитела против IgG кролика, полученные в козе и конъюгированные со щелочной фос-фатазой, GAR-FITC — антитела против IgG кролика, полученные в козе, конъюгированы с Fluores-cein isothiocyanate, GAR-Rhodamin — антитела против IgG кролика, полученные в козе, конъюги-рованы с Rhodamin, EDTA — ethylenediaminetetra-acetic acid, PBS — фосфатно-солевой буфер, PMSF — phenyl methyl sulfonyl fluoride.
ВВЕДЕНИЕ
Представители типа Кишечнополостные (Coe-lenterata или Cnidaria) — низшие многоклеточные животные, тело которых образовано двумя эпителиальными слоями (эпи- и гастродермой), между которыми расположена прослойка мезоглеи (Chapman D., 1974; Harrison, Westfall, 1991). Степень развития мезоглеи варьирует не только у представителей разных классов, но и на разных стадиях жизненного цикла. Мезоглея определяет форму тела животного. Она участвует в транспорте
и накоплении питательных веществ (Bouillon, Coppois, 1977; Weber, Schmid, 1985). Мезоглея сцифоидной медузы вида Aurelia aurita (класс Scypho-zoa, отр. Semaestomae, сем. Ulmaridae) и многих других представителей классов Scyphozoa и Antho-zoa заселена свободными подвижными клетками — мезоглеальными клетками (Chapman G., 1966). Наличие мезоглеальных клеток в мезоглее не универсально. У тех видов, у которых встречаются амебоидные мезоглеальные клетки, мезоглея приобретает гистологическое сходство с соединительными тканями высших животных (Заварзин, 1945; Chapman D., 1974).
Среди полипептидов мезоглеи зрелых медуз A. aurita, определенных с помощью денатурирующего электрофореза по Лэммли, определяется несколько мажорных белков. Одним из них является белок с молекулярной массой 47 кДа — мезоглеин (Matveev et al., 2007). При помощи антител (RA47), полученных к мезоглеину, удалось определить его локализацию — в специфических гранулах мезоглеальных клеток и в составе "эластических" волокон межклеточного матрикса мезоглеи зрелых медуз (Shaposhnikova et al., 2005). Вероятно, что мезоглеин синтезируется в виде белка-предшественника в мезоглеальных клетках, а затем подвергается
посттрансляционным модификациям и выводится в матрикс мезоглеи.
В составе мезоглеина выявлено два функциональных домена: ZP (Zona Pellucida) и DSL (Del-ta/Serrate/Lag-2). Наличие первого из них дало основание отнести белок к обширному суперсемейству ZP-домен-содержащих белков. В суперсемейство входят в основном внеклеточные белки. У представителей разных ветвей эволюционного древа в 2005 году описано около 700 белков, содержащих этот домен (Jovine et al., 2005), сейчас их количество приближается к 1000. Свое название семейство получило потому, что первыми описанными белками стали три гликопротеина Zona Pellucida плацентарных млекопитающих, отличительной особенностью которых был цистеин-бо-гатый домен, локализованный на С-конце полипептида — ZP-домен (Wassarman et al., 1999).
ZP-домен-содержащие белки обнаружены как у высших многоклеточных (ZP1-3, а- и ß-текто-рин, рецептор TGF-ß и многие другие), так и у представителей более низших в эволюционном плане животных (VERL у моллюска H. rufescens, белки дрозофилы NompA, Cuticlin-1 и др.) (Tarin and Cano, 2000). ZP-доменные белки характеризуются мозаичным строением, между сигнальным N-пептидом и ZP-доменом в их состав входят разные и в разных комбинациях структурно-функциональные домены (Jovine, 2005). При всем разнообразии биологических функций представителей семейства, в основном они являются структурными компонентами, и/или выполняют рецептор-ную функцию.
Большая часть описанных ZP-домен-содержа-щих белков вовлечена в процессы оплодотворения как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных (Tarin, Cano, 2000; Wassarman, 2009). Подобные белки у низших беспозвоночных животных (кишечнополостные, гребневики, губки) до работ нашей группы описаны не были. Мезоглеин оказался представителем семейства ZP-белков, поэтому мы предположили, что если ген мезоглеина является эволюционным приобретением A. aurita, то его ZP-домен может быть вовлечен и в процесс оплодотворения.
В аминокислотной последовательности мезо-глеина ZP-домен занимает более половины всего белка (Matveev et al., 2007). Вероятно, что антитела поликлональной сыворотки RA47 распознают именно ZP-домен мезоглеина. На парафиновых срезах тканей гонад половозрелых самок A. aurita антитела выявляют материал в области контакта ооцитов с зачатковым эпителием. Для удобства описания структуре присвоено название пластинки контакта (Адонин и др., 2009). Морфология и динамика образования пластинки контакта нуждаются в описании, чему и посвящена настоящая работа.
Изучение формирования пластинки контакта затруднено тем, что оогенез у представителей класса Scyphozoa описан неполно. Первые работы по микроанатомическому строению тканей медуз относятся еще к 19—началу 20 вв.: Особенности строения гонад у разных видов сцифоидных медуз использовали для построения филогенетического древа (Haeckel, 1881; Claus, 1883; Maas, 1897; Van-höffen, 1902 — цит. по Morandini et al., 2001). Известно, что ооциты сцифоидных медуз возникают из зачаткового эпителия, который выстилает стенки полового синуса (рис. 1), являющегося производным гастродермы (Иванова-Казас, 1975; Eckelbarger, Larson, 1988, 1992).
Мы выделили семь (I—VII) последовательных стадий в развитии ооцита, основываясь на работе Экельбаргера и Ларсона (1988) и собственных наблюдениях (Адонин и др., 2009). Основной критерий выделения стадий — диаметр ооцита (от 10 мкм на I стадии, до 170 мкм на последнем этапе созревания) и наличие специфических гранул (рис. 1). В настоящей работе мы исследовали морфологические особенности образования пластинки контакта в ходе формирования ооцита у сцифо-медузы A. aurita.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Сбор материала. Объект исследования — поло-возрезые самки Aurelia aurita (класс Scyphozoa, отр. Semaestomae, ceм. Ulmaridae) с диаметром зонтика 15 см и более. A. aurita — вид-космополит, но материал настоящей работы собран в популяции, обитающей в Чупинской губе Белого моря. Медуз собирали сачком с весельной лодки в окрестностях Беломорской биологической станции Картеш Зоологического института РАН.
Животных препарировали, отделяя гонады с помощью пинцета и скальпеля от эпидермы и га-стродермы. Кусочки ткани для молекулярных исследований замораживались (—20°С) и дальнейшее исследование производилось в условиях стационарной лаборатории Биолого-почвенного факультета СПбГУ. Часть материала фиксировали для световой и электронной микроскопии (см. разделы Иммунофлюоресценция, Полутонкие срезы и Ультратонкие срезы).
Полутонкие срезы. Кусочки гонад самокA. aurita с прилежащей мезоглеей фиксировали в 2% растворе глютаральдегида на какодилатном буфере и дофиксировали в 1% растворе OsО4. Фиксированный материал заливали в эпон по методике, предложенной производителем (Sigma, USA). Срезы толщиной 0.5 мкм изготавливали на ультратоме Leica EM UK6. Полученные срезы окрашивали 0.1% раствором кислого фуксина на 30% этаноле в течение 1—2 мин при постоянном подогреве (до 60°С), после чего краску смывали проточной ди-
Рис. 1. Стадии развитие ооцита сцифоидной медузы Aurelia aurita. А — общая схема расположения гонады, продольный срез через тело медузы. Б — схема гонады (из Экельбаргера и Ларсона (Eckelbarger, Larson, 1988), с изменениями). 1—5 — стадии развития ооцита по Экельбаргеру и Ларсону; I—VII — стадии развития ооцита по Адонину и др. (2009).
стиллированной водой. Наблюдение и фотосъемку проводили на микроскопе Leica DM 6000B.
Ультратонкие срезы. Материал для приготовления ультратонких срезов фиксировали так же, как описано в разделе "Полутонкие срезы". Заливка в эпоновые блоки производилась согласно методике производителя (Sigma, USA). Приготовление ультратонких срезов (65—70 нм толщиной) осуществлялось на ультратоме Leica EM UK6.
После переноса срезов на поддерживающие сеточки (West Chester, PA, USA), срезы контрастировали по следующей методике: насыщенный раствор уранилацетата (20—25 мин), после которого следовала
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.