БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2010, № 2, с. 77-85
УДК 597.556.3-11+597:579
МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ СЛИЗИСТУЮ КИШЕЧНИКА ЩУКИ (Esox lucius L.) © 2010 г. А. О. Плотников*, Ж. В. Корнева**, Г. И. Извекова**
*Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН,
460000 Оренбург, ул. Пионерская, д. 11 **Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: janetta@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 16.07.2008 г
Установлено, что в микрофлоре кишечника щуки преобладают представители грамотрицательных бактерий класса Оаттарго1еоЪас1епа. Морфофизиологические особенности выделенных микроорганизмов позволяют предположить, что они относятся к симбионтной микрофлоре кишечника. Морфологические характеристики симбионтной микрофлоры кишечника щуки включают образование капсул, псевдовакуолей и сферопластных клеток. Обнаруженные бактерии способны продуцировать гидролитические ферменты и обладают персистентными свойствами. Установленные морфофизиологические особенности способствуют адаптации бактерий к условиям существования и свидетельствуют об автохтонном характере кишечной микрофлоры рыб.
Ключевые слова: микрофлора кишечника, рыбы, ультраструктура бактерий, ферментативная активность, персистентные свойства.
ВВЕДЕНИЕ
Микрофлора кишечника наиболее тщательно изучена у человека и насчитывает до 400 видов различных микроорганизмов [21]. В то же время несмотря на интенсивное исследование кишечной микрофлоры рыб [6, 16, 24], ее состав до конца неизвестен. Из пищеварительного тракта пресноводных рыб выделены преимущественно представители родов Enterobacter, Aeromonas и Acinetobacter [24], также встречаются Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Alcaligenes, Eikenella, Bacteroides, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Cytophaga/Flexibacter, Bacillus, Listeria, Propionibacterium, Staphylococcus, Moraxella и Pseudomonas [19].
Видовой состав кишечной микрофлоры щуки фактически не исследован. В содержимом ее кишечника найдены Pseudomonas spp., Bacillus spp. и коринеформные бактерии (неспорообразующие факультативно анаэробные грамположительные палочки, они относятся к нескольким родам, преимущественно сем. Corynebacteriaceae) [10]. В большей части имеющихся работ рассматривается микрофлора содержимого кишечника рыб [16, 24], тогда как данных о микрофлоре слизистой оболочки кишечника мало.
У бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника рыб, обнаружен ряд ультраструктурных особенностей, способствующих их адаптации к условиям обитания: слизистая капсула; фибрилляр-
ный материал, облегчающий адгезию; специализированные контакты с эпителиоцитами кишечника; образование нанноформ [8, 12, 13]. В то же время ультраструктура бактерий, колонизирующих кишечник щуки, фактически не изучена.
Бактерии играют важную роль в питании рыб, снабжая их основными жирными кислотами, витаминами, минеральными веществами и ферментами [25]. Одно из направлений исследования кишечной микрофлоры — оценка ее роли в питании рыб за счет выделения бактериями внеклеточных ферментов, способных принимать участие в гидролизе биополимеров. Представляется важным определение метаболической активности отдельных видов бактерий, связанных со слизистой кишечника рыб, и прежде всего их способность синтезировать пищеварительные ферменты, что позволит выяснить значение микроорганизмов в питании хозяина.
В последнее время большое внимание уделяется способности некоторых бактерий кишечной микрофлоры человека инактивировать механизмы антибактериальной защиты хозяина, такие как лизо-цим, комплемент, секреторные иммуноглобулины и др. [1]. Эти свойства названы соответственно ан-тилизоцимной, антикомплементарной, антиимму-ноглобулиновой активностями. Считается, что они обеспечивают устойчивую циркуляцию симбионт-ных микроорганизмов, способствуя их персистен-
ции [1]. Персистентные свойства бактерий кишечной микрофлоры рыб пока не исследованы.
Цель работы — выделение бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника щуки, исследование их ультраструктурных особенностей, способности продуцировать гидролитические ферменты и определение их персистентных свойств.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служила слизистая оболочка кишечника щуки (Esox Ыат L.). Серозную поверхность кишечника обрабатывали 70%-ным спиртом, подсушивали стерильной марлевой салфеткой и вскрывали кишечник в асептических условиях. Смывы с кишечника щуки для дальнейших микробиологических посевов получали, используя модификацию метода последовательной десорбции ферментов с отрезков кишки, как описано ранее [7]. Первую фракцию Д1 получали после 30-секундного встряхивания, остальные Д2—Д5 — через каждые последующие 15 мин. Для микробиологических исследований использовали фракции Д1, Д3 и Д5. В ряду Д1—Д5, т.е. по мере приближения к поверхности, прочность ассоциации бактерий с пищеварительно-транспортными поверхностями возрастает и соответствует распределению микрофлоры в кишечнике — от полостной микрофлоры во фракциях Д1—Д2 до глубинной (пристеночной) во фракциях Д3—Д5. Гомогенат слизистой оболочки кишечника получали, растирая фрагмент слизистой с девятикратным (масса/объем) количеством раствора Рингера в стерильной ступке.
Чистые культуры бактерий получали, высевая 0.1 мл неразведенных и разведенных в 10, 100 и 1000 раз фракций или гомогената на твердые питательные среды: "голодный" агар, кровяной агар, 1.5%-ный мясо-пептонный агар, висмут-сульфит-агар, среду Эндо и среду Плоскирева. Через 48—72 ч культивирования при температуре 25°С выросшие колонии пересевали на скошенный питательный агар и идентифицировали. Видовую идентификацию выделенных штаммов осуществляли, используя определители [22, 29], на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических критериев с применением планшетных тест-систем "ENTEROtest" и "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия). Для идентификации аэромонад применяли дополнительные тесты в соответствии с рекомендациями [17, 23].
Морфологические особенности выделенных штаммов изучали в двухсуточных и семисуточных культурах с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Для этого колонии бактерий фиксировали 2.5%-ным раствором глутарового альдегида на какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 1—2 сут, дофиксировали 2%-ным раствором тетра-оксида осмия в течение 1 ч на том же буфере, дегид-
ратировали в спиртах и ацетоне. После дегидратации материал заливали в смесь эпон—аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011.
При оценке ферментативной активности выделенных бактерий культуры вносили в количестве одной стандартной бактериологической петли диаметром 3 мм в пробирки с 10 мл специальных жидких питательных сред следующего состава: 1) для определения протеолитической активности — 3.5 г сухого рыбопептонного бульона на 1 л раствора Рингера; 2) для определения амилолитической активности — 3.5 г рыбопептонного бульона и 10 г растворимого крахмала на 1 л раствора Рингера. Среды, инокулированные микроорганизмами, культивировали в течение 3 сут при температуре 25°С, после чего в них определяли активность ферментов бактерий. Общую амилолитическую активность определяли модифицированным методом Нельсона [15]; общую протеолитическую активность — методом Ансона [18]. Интенсивность развивающегося окрашивания, пропорционального активности ферментов, измеряли на спектрофотометре СФ-46.
Антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом [1] по зонам стимуляции роста индикаторной культуры Micrococcus luteus (№ 2665, ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича) над колониями исследуемых штаммов, выращенных на среде с яичным лизоци-мом ("Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова). Величину антилизоцимной активности микроорганизмов выражали в микрограммах инактивированного лизоцима на 1 мл среды. Антигистоновую активность микроорганизмов определяли методом фотометрической регистрации степени задержки роста индикаторного штамма Micrococcus luteus (№ 2665, ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича) после его инкубации с супернатантом исследуемой культуры и препаратом общей фракции гистонов из тимуса теленка ("Sigma", США) [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделены гетеротрофные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, относящиеся к семи родам и девяти видам. Восемь видов относятся к бактериям различного таксономического положения и вид Cryptococcus neoformans — к эукари-отическим грибам. Все виды бактерий представляют собой грамотрицательные микроорганизмы класса Gammaproteobacteria, пяти различных семейств (Enterobacteriaceae: Hafnia alvei, Yersinia ruckeri; Vibrionaceae: Vibrio vulnificus, V. furnissii; Aero-monadaceae: Aeromonas eucrenophila; A. salmonicida ssp. salmonicida; Alteromonadaceae: Shewanella putre-faciens; Pseudomonadaceae: Pseudomonas luteola).
Hafnia alvei, Shewanella putrefaciens, представители рода Vibrio обнаружены во всех исследованных фракциях Д1, Д3 и Д5 и в гомогенате слизистой. Бактерии рода Aeromonas присутствуют во фракциях Д3 и Д5 и в гомогенате. Yersinia ruckeri и Cryptococ-cus neoformans выделены только из легко смываемой фракции Д1, а Pseudomonas luteola — напротив, только из гомогената слизистой кишечника.
У представителей всех выделенных родов бактерий исследованы морфологические и ультраструктурные особенности в "молодых" двухсуточных культурах, находящихся в стадии стационарного роста, и в "старых" семисуточных культурах в фазе отмирания.
Hafnia alvei. Палочки, часто удлиненные 1.0...5.3 х 0.5...0.8 мкм, лишенные капсулы (рис. 1а). При голодании наблюдаются изменения нуклеои-да, проявляющиеся в разрыхлении его структуры, появлении четкой границы с периферической зоной цитоплазмы, формировании грубофибрилляр-ных нитей и электронно-плотных глобулярных включений (рис. 1б). При этом клеточная стенка, как правило, остается интактной, реже наблю
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.