научная статья по теме МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ СЛИЗИСТУЮ КИШЕЧНИКА ЩУКИ (ESOX LUCIUS L.) Биология

Текст научной статьи на тему «МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ СЛИЗИСТУЮ КИШЕЧНИКА ЩУКИ (ESOX LUCIUS L.)»

БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2010, № 2, с. 77-85

УДК 597.556.3-11+597:579

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ СЛИЗИСТУЮ КИШЕЧНИКА ЩУКИ (Esox lucius L.) © 2010 г. А. О. Плотников*, Ж. В. Корнева**, Г. И. Извекова**

*Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН,

460000 Оренбург, ул. Пионерская, д. 11 **Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: janetta@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 16.07.2008 г

Установлено, что в микрофлоре кишечника щуки преобладают представители грамотрицательных бактерий класса Оаттарго1еоЪас1епа. Морфофизиологические особенности выделенных микроорганизмов позволяют предположить, что они относятся к симбионтной микрофлоре кишечника. Морфологические характеристики симбионтной микрофлоры кишечника щуки включают образование капсул, псевдовакуолей и сферопластных клеток. Обнаруженные бактерии способны продуцировать гидролитические ферменты и обладают персистентными свойствами. Установленные морфофизиологические особенности способствуют адаптации бактерий к условиям существования и свидетельствуют об автохтонном характере кишечной микрофлоры рыб.

Ключевые слова: микрофлора кишечника, рыбы, ультраструктура бактерий, ферментативная активность, персистентные свойства.

ВВЕДЕНИЕ

Микрофлора кишечника наиболее тщательно изучена у человека и насчитывает до 400 видов различных микроорганизмов [21]. В то же время несмотря на интенсивное исследование кишечной микрофлоры рыб [6, 16, 24], ее состав до конца неизвестен. Из пищеварительного тракта пресноводных рыб выделены преимущественно представители родов Enterobacter, Aeromonas и Acinetobacter [24], также встречаются Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Alcaligenes, Eikenella, Bacteroides, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Cytophaga/Flexibacter, Bacillus, Listeria, Propionibacterium, Staphylococcus, Moraxella и Pseudomonas [19].

Видовой состав кишечной микрофлоры щуки фактически не исследован. В содержимом ее кишечника найдены Pseudomonas spp., Bacillus spp. и коринеформные бактерии (неспорообразующие факультативно анаэробные грамположительные палочки, они относятся к нескольким родам, преимущественно сем. Corynebacteriaceae) [10]. В большей части имеющихся работ рассматривается микрофлора содержимого кишечника рыб [16, 24], тогда как данных о микрофлоре слизистой оболочки кишечника мало.

У бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника рыб, обнаружен ряд ультраструктурных особенностей, способствующих их адаптации к условиям обитания: слизистая капсула; фибрилляр-

ный материал, облегчающий адгезию; специализированные контакты с эпителиоцитами кишечника; образование нанноформ [8, 12, 13]. В то же время ультраструктура бактерий, колонизирующих кишечник щуки, фактически не изучена.

Бактерии играют важную роль в питании рыб, снабжая их основными жирными кислотами, витаминами, минеральными веществами и ферментами [25]. Одно из направлений исследования кишечной микрофлоры — оценка ее роли в питании рыб за счет выделения бактериями внеклеточных ферментов, способных принимать участие в гидролизе биополимеров. Представляется важным определение метаболической активности отдельных видов бактерий, связанных со слизистой кишечника рыб, и прежде всего их способность синтезировать пищеварительные ферменты, что позволит выяснить значение микроорганизмов в питании хозяина.

В последнее время большое внимание уделяется способности некоторых бактерий кишечной микрофлоры человека инактивировать механизмы антибактериальной защиты хозяина, такие как лизо-цим, комплемент, секреторные иммуноглобулины и др. [1]. Эти свойства названы соответственно ан-тилизоцимной, антикомплементарной, антиимму-ноглобулиновой активностями. Считается, что они обеспечивают устойчивую циркуляцию симбионт-ных микроорганизмов, способствуя их персистен-

ции [1]. Персистентные свойства бактерий кишечной микрофлоры рыб пока не исследованы.

Цель работы — выделение бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника щуки, исследование их ультраструктурных особенностей, способности продуцировать гидролитические ферменты и определение их персистентных свойств.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила слизистая оболочка кишечника щуки (Esox Ыат L.). Серозную поверхность кишечника обрабатывали 70%-ным спиртом, подсушивали стерильной марлевой салфеткой и вскрывали кишечник в асептических условиях. Смывы с кишечника щуки для дальнейших микробиологических посевов получали, используя модификацию метода последовательной десорбции ферментов с отрезков кишки, как описано ранее [7]. Первую фракцию Д1 получали после 30-секундного встряхивания, остальные Д2—Д5 — через каждые последующие 15 мин. Для микробиологических исследований использовали фракции Д1, Д3 и Д5. В ряду Д1—Д5, т.е. по мере приближения к поверхности, прочность ассоциации бактерий с пищеварительно-транспортными поверхностями возрастает и соответствует распределению микрофлоры в кишечнике — от полостной микрофлоры во фракциях Д1—Д2 до глубинной (пристеночной) во фракциях Д3—Д5. Гомогенат слизистой оболочки кишечника получали, растирая фрагмент слизистой с девятикратным (масса/объем) количеством раствора Рингера в стерильной ступке.

Чистые культуры бактерий получали, высевая 0.1 мл неразведенных и разведенных в 10, 100 и 1000 раз фракций или гомогената на твердые питательные среды: "голодный" агар, кровяной агар, 1.5%-ный мясо-пептонный агар, висмут-сульфит-агар, среду Эндо и среду Плоскирева. Через 48—72 ч культивирования при температуре 25°С выросшие колонии пересевали на скошенный питательный агар и идентифицировали. Видовую идентификацию выделенных штаммов осуществляли, используя определители [22, 29], на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических критериев с применением планшетных тест-систем "ENTEROtest" и "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия). Для идентификации аэромонад применяли дополнительные тесты в соответствии с рекомендациями [17, 23].

Морфологические особенности выделенных штаммов изучали в двухсуточных и семисуточных культурах с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Для этого колонии бактерий фиксировали 2.5%-ным раствором глутарового альдегида на какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 1—2 сут, дофиксировали 2%-ным раствором тетра-оксида осмия в течение 1 ч на том же буфере, дегид-

ратировали в спиртах и ацетоне. После дегидратации материал заливали в смесь эпон—аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011.

При оценке ферментативной активности выделенных бактерий культуры вносили в количестве одной стандартной бактериологической петли диаметром 3 мм в пробирки с 10 мл специальных жидких питательных сред следующего состава: 1) для определения протеолитической активности — 3.5 г сухого рыбопептонного бульона на 1 л раствора Рингера; 2) для определения амилолитической активности — 3.5 г рыбопептонного бульона и 10 г растворимого крахмала на 1 л раствора Рингера. Среды, инокулированные микроорганизмами, культивировали в течение 3 сут при температуре 25°С, после чего в них определяли активность ферментов бактерий. Общую амилолитическую активность определяли модифицированным методом Нельсона [15]; общую протеолитическую активность — методом Ансона [18]. Интенсивность развивающегося окрашивания, пропорционального активности ферментов, измеряли на спектрофотометре СФ-46.

Антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом [1] по зонам стимуляции роста индикаторной культуры Micrococcus luteus (№ 2665, ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича) над колониями исследуемых штаммов, выращенных на среде с яичным лизоци-мом ("Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова). Величину антилизоцимной активности микроорганизмов выражали в микрограммах инактивированного лизоцима на 1 мл среды. Антигистоновую активность микроорганизмов определяли методом фотометрической регистрации степени задержки роста индикаторного штамма Micrococcus luteus (№ 2665, ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича) после его инкубации с супернатантом исследуемой культуры и препаратом общей фракции гистонов из тимуса теленка ("Sigma", США) [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделены гетеротрофные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, относящиеся к семи родам и девяти видам. Восемь видов относятся к бактериям различного таксономического положения и вид Cryptococcus neoformans — к эукари-отическим грибам. Все виды бактерий представляют собой грамотрицательные микроорганизмы класса Gammaproteobacteria, пяти различных семейств (Enterobacteriaceae: Hafnia alvei, Yersinia ruckeri; Vibrionaceae: Vibrio vulnificus, V. furnissii; Aero-monadaceae: Aeromonas eucrenophila; A. salmonicida ssp. salmonicida; Alteromonadaceae: Shewanella putre-faciens; Pseudomonadaceae: Pseudomonas luteola).

Hafnia alvei, Shewanella putrefaciens, представители рода Vibrio обнаружены во всех исследованных фракциях Д1, Д3 и Д5 и в гомогенате слизистой. Бактерии рода Aeromonas присутствуют во фракциях Д3 и Д5 и в гомогенате. Yersinia ruckeri и Cryptococ-cus neoformans выделены только из легко смываемой фракции Д1, а Pseudomonas luteola — напротив, только из гомогената слизистой кишечника.

У представителей всех выделенных родов бактерий исследованы морфологические и ультраструктурные особенности в "молодых" двухсуточных культурах, находящихся в стадии стационарного роста, и в "старых" семисуточных культурах в фазе отмирания.

Hafnia alvei. Палочки, часто удлиненные 1.0...5.3 х 0.5...0.8 мкм, лишенные капсулы (рис. 1а). При голодании наблюдаются изменения нуклеои-да, проявляющиеся в разрыхлении его структуры, появлении четкой границы с периферической зоной цитоплазмы, формировании грубофибрилляр-ных нитей и электронно-плотных глобулярных включений (рис. 1б). При этом клеточная стенка, как правило, остается интактной, реже наблю

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»