ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 1, с. 108-117
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЫ ЭКСПАНСИНОВ AtEXPA10 АРАБИДОПСИСА И PnEXPAl ТОПОЛЯ © 2012 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, Я. П. Лебедев, А. В. Чемерис
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа
Поступила в редакцию 17.02.2011 г.
Экспансины представляют собой неферментативные белки растений, разрушающие водородные связи между целлюлозными микрофибриллами и гемицеллюлозным матриксом полимеров. В каждом растении экспансины представлены множеством генов, белковые продукты которых участвуют в регуляции роста и развития растений, в основном путем регуляции клеточного растяжения. С целью изучения влияния повышенной экспрессии экспансинов на величину органов растений, мы клонировали гены AtEXPA10Arabidopsis thaliana и PnEXPA1 Populus nigra L. Были получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующие исследуемые гены. У полученных трансгенных растений табака было показано существенное увеличение размеров листьев и стеблей по сравнению с контрольными растениями. Размеры цветков увеличивались весьма незначительно, но при этом трансгенные растения характеризовались увеличением количества цветков. Микроскопические исследования показали, что размеры органов трансгенных по AtEXPA10 растений табака увеличивались в основном за счет стимулирования клеточной пролиферации, тогда как сверхэкспрессия гена PnEXPA1 активировала клеточное растяжение.
Ключевые слова: Populus nigra - Nicotiana tabacum - AtEXPA10 - PnEXPA1 - 35S промотор - трансгенные растения - клеточное растяжение - регуляция роста - величина органов
ВВЕДЕНИЕ
Размеры и форма органов растений являются очень важными признаками, которые находятся под жестким генетическим контролем. Конечные размеры растительных органов определяются как величиной клеток, так и их количеством. Таким образом, манипулируя растяжением клеток и процессом клеточного деления, можно изменять размеры органа. Увеличение объема растительной клетки происходит, в основном, за счет поглощения воды центральной вакуолью, но из-за жесткости клеточной стенки растяжение возможно лишь при размягчении и разрушении связей между целлюлозными микрофибриллами. В растениях растяжимость тканей регулируется путем подкисления клеточных стенок и увеличения экспрессии особых неферментативных белков экспансинов. Основываясь на степени филогенетического родства, экспансины делят на четыре семейства: 1) экспансины А (ЕХРА), или а-экспанси-ны; 2) экспансины В (ЕХРВ), или Р-экспансины; 3) экспансиноподобные белки А (ЕХЬА); 4) экс-пансиноподобные белки В (ЕХЬВ) [1]. Первыми были открыты ЕХРА: в 1992 г. их выделили из кле-
Адрес для корреспонденции: Кулуев Булат Разяпович. 450054 Уфа, просп. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Электронная почта: Ки-luev@bk.ru
точных стенок гипокотилей огурца [2]. Год спустя гомологичные белки, с которыми реагировали антитела, выработанные против экспансинов огурца, выделили из колеоптилей овса [3]. Экспансины В были выделены из пыльцы злаковых и оказались частично гомологичны экспансинам А [4].
В каждом растении экспансины кодируются множеством генов. Полностью секвенированный геном арабидопсиса содержит 36 генов экспансинов: 26 ЕХРА, шесть ЕХРВ, три ЕХЬА и один ЕХЬВ [1]. Экспансины — это небольшие щелочные белки, полипептидная цепь которых состоит из 250270 аминокислотных остатков [1]. Предполагается, что экспансины участвуют в разрыве некова-лентных связей между целлюлозными микрофибриллами и гликановыми поперечными мостиками, способствуя, тем самым, деформации клеточной стенки [5]. Было показано, что экспрессия некоторых изоформ экспансинов коррелировала с ростом таких структур, как гипокоти-ли, колеоптили, междоузлия, побеги, листья, корни и незрелые плоды [5].
На данный момент известно, что экспансины регулируют не только растяжение клеток, но являются более универсальными белками, участвуя в ряде формообразовательных и деструктивных процессов [1]. Повышенная экспрессия гена А(ЕХРЛ1 ЛгаЪ1йор515 ЛаНапа приводила к задержке
роста побегов, особенно в ранней фазе вегетативного роста, кроме того, было обнаружено повышение устойчивости таких трансгенных растений к действию стрессовых факторов [5]. Сверхэкспрессия таких генов, как CsEXPA1 и OsEXPA4, также существенно влияла на рост трансгенных растений. Большой интерес представляет ген AtEXPA10 арабидопсиса, который активно экс-прессируется в черешках и трихомах растущих листьев и в базальной области черешка [6]. Растения арабидопсиса с повышенным уровнем экспрессии данного гена характеризовались увеличением длины черешков и площади листовой пластинки. В то же время, трансгенные растения с антисмысловой ориентацией гена, наоборот, отличались уменьшением размера листьев [6]. Повышенная экспрессия гена PttEXPA1 осины может вызывать увеличение размеров клеток, что выражалось в увеличении размеров стеблей и листьев [7]. Однако остается открытым вопрос, будет ли экспрессия этих генов влиять на рост и развитие растения в гетерологичной среде. Для получения ответа на этот вопрос нами были созданы трансгенные растения табака, экспрессирующие ген AtEXPA10 арабидопсиса и гомологичный гену PttEXPA1 ген PnEXPA1 из тополя черного.
Экспансины, наряду с различными транскрипционными факторами являются одними из важнейших факторов, участвующих в регуляции роста и развития растений. Предполагается, что манипуляции с изменением уровня экспрессии этих генов могут привести к созданию трансгенных растений с увеличенными или уменьшенными органами. Такие растения могут быть востребованы в сельском и лесном хозяйствах, а также для декоративных целей.
В настоящей работе описываются эксперименты по выделению и исследованию гомолога гена PttEXPA1 из тополя черного, которому мы дали название PnEXPA1, и влияния повышенной экспрессии как данного гена, так и гена AtEXPA10 на величину органов и скорость роста трансгенных растений табака. Предполагалось, что повышенная экспрессия этих генов будет способствовать увеличению размеров листьев, стеблей и цветков трансгенных растений табака.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции, последовательности олигонуклеотидных праймеров. В работе использованы бактерии Escherichia coli штамма XL 1-Blue и Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. Из плазмид использовали Т-вектор pKRX и бинарный вектор pCambia 1301 с геном устойчивости к гигромицину и репортерным геном GUS ("CAMBIA", Австралия). Тотальную ДНК Arabidop-sis thaliana и тополя черного (Populus nigra L.) выде-
ляли методом солевой экстракции [8]. Выделенную таким образом ДНК очищали при помощи набора для очистки ДНК фирмы "Цитокин" (Россия) и использовали в качестве матрицы при проведении ПЦР. Тотальную РНК выделяли при помощи тризола фирмы "Invitrogen" (США). ОТ-ПЦР осуществляли при помощи MuLV-обратной транскриптазы ("Fermentas", Литва). Плазмид-ную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний при помощи набора фирмы "Цитокин". Расщепление ДНК проводили при помощи различных эндонуклеаз рестрикции в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками ("Сибэнзим", Россия; "Fermentas"). Лигирование осуществляли при помощи Т4 ДНК-лигазы ("Силекс", Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI ("BioRad", США). Элюцию фрагментов ДНК проводили из легкоплавкой агарозы или при помощи набора для очистки ДНК ("Цитокин"). Для ПЦР использовали амплификаторы производства компании "ДНК-технология" (Россия).
Ген AtEXPA10 выделили из тотальной ДНК арабидопсиса при помощи праймеров AtEXPF AGACGTAAACATGGGTCATC и AtEXPR TGC-CCTTTTTAACGGAACTG. Для ОТ-ПЦР гена AtEXPA10 использовали праймеры ATGGGT-CATCTTGGGTTCTT и TTAACGGAACTGTC-CACCGG. Ген PnEXPA1 амплифицировали при помощи праймеров PnEXP1F GAGAGAAAATG-GCAATGAGC и PnEXP1R TATTAAACCCT-GAAATTCTTGCC. Для ОТ-ПЦР гена PnEXPA1 использовали праймеры ATGGCAATGAG-CAGTTTAAT и TTAAACCCTGAAATTCTTGC. Для получения ампликонов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-полимеразу ("Сибэнзим"), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-полимеразу ("Сибэнзим"). Для поиска целевых клонов при лигировании в векторе pCambia 1301 использовали праймер 35SCambF: AGAGGACCTAACAGAACTCG в паре с прайме-ром 1301R TGCTCTAGCATTCGCCATTC. Секве-нирование проводили на автоматическом секве-наторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США). Электропорацию компетентных клеток A. tumefaciens проводили при помощи электропоратора фирмы "Bio-Rad" модели Mi-cropulser. Поиск гомологичных генов осуществляли при помощи программ MegAlign пакета Lasergene ("DNASTAR", США) и программы Mega-Blast, доступной через сайт http://www.ncbi. nlm.nih.gov.
Получение трансгенных растений табака, морфологическая характеристика и условия выращивания растений. Трансгенные формы табака (Nic-
Таблица 1. Морфологические параметры 6 линий трансгенных растений поколения Ть экспрессирующих ген AtEXPA10 арабидопсиса, и контрольных растений в зависимости от стадии развития
Параметр Трансгенные растения, номер линии Контрольные растения, номер п/п
7 9 34 39 40 43 1 2 3
Длина ли-
стьев, см
30 дней 9.7 ± 0.4 8.3 ± 0.6 9.7 ± 0.9 10.8 ± 0.6 9.3 ± 0.8 3.2 ± 0.1 4.5 ± 0.2 4.8 ± 0.3 4.6 ± 0.1
45 дней 13.0 ± 0.4 14.2 ± 0.6 14.0 ± 0.2 13.0 ± 0.4 12.0 ± 0.5 5.2 ± 0.2 5.3 ± 0.2 7.3 ± 0.6 6.8 ± 0.4
60 дней 15.3 ± 0.2 15.0 ± 0.4 15.5 ± 0.2 14.3 ± 0.6 17.0 ± 0.4 9.3 ± 0.6 10.7 ± 0.4 11.0 ± 1.0 9.0 ± 0.3
В период цве- 17.7 ± 0.2 18.7 ± 0.2 19.7 ± 0.2 15.3 ± 0.4 17.0 ± 0.4 15.4 ± 0.4 12.1 ± 0.1 16.0 ± 0.3 11.0 ± 0.4
тения
Площадь ли- 127.7 5.5 161.3 ± 5.8 154.3 ± 4.6 98.7 ± 4.2 126.3 ± 7.5 105.6 ± 3.6 6
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.