научная статья по теме МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ В ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ В ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 3, с. 233-241

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 576.3+615.361

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ В ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ

© 2013 г. О. С. Лебедева1, М. А. Лагарькова2, С. Л. Киселев2, И. В. Мухина3,

М. В. Ведунова3, О. В. Усова3, А. В. Ставровская4, Н. Г. Ямщикова4, Е. Ю. Федотова4, И. А. Гривенников1, Л. Г. Хаспеков4, С. Н. Иллариошкин4*

ФГБУН "Институт молекулярной генетики" РАН 2ФГБУН "Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова" РАН 3ГБОУВПО "Нижегородская Государственная медицинская академия" Минздрава России 4ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН

Дефицит дофамина в нигростриатной системе является ключевым нейромедиаторным нарушением, обусловливающим основные клинические проявления болезни Паркинсона. Современные методы лечения данного заболевания позволяют уменьшить выраженность отдельных симптомов, однако проводимая заместительная терапия не предотвращает дальнейшего прогрессирования нейро-дегенеративного процесса. Реальной терапевтической альтернативой при паркинсонизме может стать трансплантация в головной мозг функционально полноценных дофаминергических нейронов. В настоящей работе были получены индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), ре-программированные из фибробластов после биопсии кожи у трех пациентов с генетическими формами болезни Паркинсона (мутации в генах ЬЯЕК2 и РКК№). Плюрипотентность полученных клеток была подтверждена экспрессией соответствующих транскрипционных факторов (ОСТ4, $ОХ2 и др.) и способностью дифференцироваться в производные экто- мезо- и энтодермы. Из ИПСК пациентов были получены дофаминергические нейроны, экспрессирующие тирозингидроксилазу и обладающие спонтанной сетевой биоэлектрической активностью при культивировании на мульти-электродной матрице. У крыс с токсической б-ОНЛА-моделью паркинсонизма трансплантация полученных дофаминергических нейронов в полосатое тело приводила к отчетливому улучшению двигательных функций и редукции симптоматики паркинсонизма.

Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, дофаминергические нейроны, мультиэлектродная матрица, паркинсонизм, нейротрансплантация.

DOI: 10.7868/S1027813313030084

Болезнь Паркинсона — одно из наиболее частых и социально значимых нейродегенератив-ных заболеваний нервной системы, встречающееся повсеместно. Распространенность болезни Паркинсона достигает 250 случаев на 100000 населения, причем доля заболевших значительно возрастает в старших возрастных группах (до 1— 2% среди лиц старше 60 лет) [1]. Основные клинические проявления данного заболевания (бра-дикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя) обусловлены гибелью нейронов черной субстанции среднего мозга, продуцирующих дофамин, и дегенерацией нигростриатного дофаминергиче-

*Адресат для корреспонденции: 125367 Москва, Волоколамское ш., 80, тел.: (495) 490-20-43, факс: (495) 490-20-02; e-mail: sni@neurology.ru.

ского пути [2, 3]. Коррекция нейромедиаторного дисбаланса в ЦНС с помощью леводопы и других препаратов позволяет уменьшить выраженность отдельных симптомов и улучшить качество жизни пациентов, однако не предотвращает дальнейшего прогрессирования нейродегенеративного процесса и является лишь паллиативным [4].

Весьма перспективным подходом к терапии болезни Паркинсона в настоящее время признается восполнение дефицита дофамина с применением клеточной заместительной терапии, осуществляемой путем трансплантации в головной мозг больного зрелых, полноценных по своим морфофункциональным характеристикам дофа-минергических нейронов [5]. До настоящего времени в качестве основного источника таких клеток рассматривались фетальные ткани (клетки

черной субстанции, получаемые из мозга эмбрионов) либо дофаминергические нейроны, дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Однако данный подход, применявшийся в экспериментальных протоколах для лечения болезни Паркинсона, себя не оправдал. Это связано, в первую очередь, с неразрешимыми этическими проблемами (необходимость использования человеческих эмбрионов) и с иммунологической несовместимостью клеток донора с мозгом реципиента [6—8]. Использование при нейродегенеративных заболеваниях региональных мультипотентных стволовых клеток, получаемых из пуповинной крови, костного мозга, жировой и других тканей, сопровождалось обычно лишь минимальным и неспецифическим клиническим эффектом либо давало отрицательный результат [9, 10], а сама возможность дифференци-ровки мультипотентных стволовых клеток в нейроны была поставлена под сомнение [11].

Указанные проблемы могут быть устранены при использовании для трансплантации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), получаемых из соматических клеток (например, фибробластов кожи) пациента и дифференцированных in vitro в зрелые дофаминерги-ческие нейроны [7, 12]. Технология получения ИПСК, разработанная в 2006—2007 гг. японскими исследователями из Киотского университета, основана на экспрессии в соматических клетках ключевых транскрипционных факторов, ответственных за поддержание плюрипотентности в раннем эмбриогенезе [13, 14]. Дифференцировка из ИПСК дофаминергических нейронов имеет принципиальное значение для решения фундаментальных вопросов патогенеза болезни Пар-кинсона, тестирования новых лекарственных препаратов с дофаминергическим и нейропро-текторным действием, а также для продукции достаточного количества адекватного клеточного материала с целью нейротрансплантации.

В настоящей работе дана морфофункциональ-ная характеристика ИПСК, полученных из фиб-робластов кожи здоровых доноров и пациентов с болезнью Паркинсона и дифференцированных в дофаминергичесие нейроны. Кроме того, показана потенциальная возможность коррекции неврологических нарушений при трансплантации этих клеток крысам с экспериментальной моделью паркинсонизма.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Пациенты. В настоящее исследование были включены три пациента с генетически обусловленными формами болезни Паркинсона. Двое пациентов страдали аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона и были гетерозиготными носителями мажорной мутации G2019S

в гене LRRK2 (хромосома 12q12, форма PARK8). Один пациент страдал аутосомно-рецессивной формой болезни и был компаунд-гетерозиготным носителем двух мутаций (IVS1 + 1G/A и делеция 2-го экзона) в гене PRKN (паркин, хромосома 6q25.2-27, форма PARK2). Формы PARK2 и PARK8 являются наиболее изученными из всех генетических вариантов первичного паркинсонизма [15]. В качестве контрольных образцов использованы клетки, полученные от двух здоровых доноров.

2. Получение образцов кожи (фибробластов) от здоровых добровольцев и пациентов с генетическим паркинсонизмом. После подписания информированного согласия у доноров под местной новокаиновой блокадой срезали расщепленные лоскуты кожи предплечья толщиной 0.2—0.3 мм и размером 0.5 х 0.5 мм. Эксплантаты сохраняли до 12 ч в среде для выделения фибробластов, содержавшей DMEM (ПанЭко или Hyclone, High glucose) с добавлением 15%-ной FBS (Hyclone), 2 мМ L-глута-мина (Hyclone), пенициллин-стрептомицина (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко) и хранившейся до 3 мес при температуре +8°C.

Далее эксплантаты в капле среды помещали на крышку чашки Петри и разрезали на небольшие фрагменты объемом порядка 0.3—1.5 мм3. Для максимально эффективного разрезания эксплантата использовали скальпели с саблевидным лезвием, при этом эксплантат удерживали пинцетом, а скальпелем "катящимися" движениями со значительным нажимом производили нарезку эксплантата. Фрагменты кожи помещали на чашку Петри и накрывали покровным стеклом. Через 1—2 нед фибробласты мигрировали на поверхность чашки и в дальнейшем культивировались до 2—3 пассажей.

3. Получение ИПСК из культивированных фиб-робластов. Для получения ИПСК фибробласты высевали на культуральные чашки (Corning, США) диаметром 35 мм, примерно по 40000 клеток на чашку. Через 2 дня клетки инфицировали четырьмя оригинальными лентивирусными векторами (LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) в различных количествах и соотношениях. Через 5 дней после инфекции клетки пересевали 1 к 12 на различные подложки: пластик (Corning, США), желатин (Sigma-Aldrich, США), матригель (BD Biosciences, США) и митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты в среде для фибробластов. На следующий после пересева день среду меняли на среду для культивирования ЭСК в фидерных условиях. Затем клетки культивировали в этой среде в течение 10—12 дней, среду меняли раз в 2 дня. К этому моменту на чашках образовывалось множество клонов с различной морфологией. Эти клоны механически пересева-

ли и культивировали раздельно в условиях культивирования ЭСК. В процессе репрограммирова-ния в среду к клеткам добавляли вальпроевую кислоту (VPA) (Sigma-Aldrich, США) и BIX-01294 (Sigma-Aldrich, США) до концентраций в среде 1 мМ и 2 мкМ, соответственно, в течение второй недели после инфекции.

4. Дифференцировка ИПСК в дофаминергиче-ские нейроны. Методика индукции дифференци-ровки ИПСК в нейроны описана ранее [20]. Кратко, ИПСК культивировали до субконфлю-энтности, затем обрабатывали диспазой (Invitro-gen, США), переносили в чашку Петри, покрытую желатином, и культивировали в DMEM/F12 (Hyclone, США) с 1% супплемента N2 (Invitrogen, США), 2% Serum replacement (Invitrogen, США), 50 нг/мл noggin (PeproTech, США). Среду меняли через день. Через 10—14 дней в культуре начинали появляться розеткоподобные структуры. После этого через две недели розетки, которые могли составлять до 70% клеток, механически, с помощью пластикового наконечника, отделяли от остальных клеток, а затем либо индуцировали дифференцировку напрямую, либо переводили культуру в суспензионную форму и культивировали в виде нейросфер, в плашках с предельно низкой адгезией Ultra Low Adhesion Plates (Corning, США) в среде DMEM/F12 (Hyclone, США), содержащей 1% N2 (Invitrogen, США), 20 нг/мл EGF (PeproTech, США) и 20 нг/мл bFGF (PeproTech, США). Нейросферы культивировали в течение двух недель. Для дифференциров

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком