ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 3, с. 202-211
= ЭМБРИОГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
УДК 591.392
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЧАСТИЧНОГО УДАЛЕНИЯ
ЦИТОПЛАЗМЫ БЛАСТОМЕРОВ В РАННЕМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ВЬЮНА Misgurnus /ОББШБ Ь.
© 2011 г. Е. Г. Ивашкин1, *, В. Г. Черданцев2
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 *Е-таИ: veliger@ya.ru
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 Поступила в редакцию 12.08.10 г.
Окончательный вариант получен 31.01.11 г.
Развитие зародышей вьюна успешно регулируется после удаления части цитоплазматического материала из одной клетки на стадиях 2-х или 4-х бластомеров или полного удаления одной или двух клеток на стадии 8-16-и бластомеров, причем регуляция складывается из двух фаз. С помощью цей-траферной съемки и морфометрического анализа показано, что в первой фазе происходит быстрое, в течение одного-двух клеточных циклов, и практически полное восстановление исходного соотношения объемов бластодиска и желточного мешка, а во второй фазе морфогенез модифицируется в соответствии с новыми особенностями строения зародыша, созданными операцией. Оставшаяся цитоплазма оперированного бластомера после нескольких этапов цитокинеза сливается с краевым желточным синцитием (перибластом), образующим на стадии бластулы заметное расширение на месте операции, которое становится местом формирования зародышевого щитка. По данным мор-фометрического анализа, восстановление относительного объема бластодермы у оперированных зародышей ведет к уменьшению величины активного натяжения границы раздела бластодермы и желтка и увеличению отношения поверхности бластодермы к ее объему в момент инициации эпи-болии. В результате конвергенция клеток бластодермы к месту операции и оформление зародышевого щитка начинаются при меньшей степени эпиболии, чем в контроле.
Ключевые слова: эмбриогенез, костистые рыбы, вьюн, дробление, удаление бластомеров, регуляция, морфогенез, морфометрия.
Эволюционно устойчивой особенностью эмбриогенеза костистых рыб является ранняя сегрегация сначала желтка и цитоплазмы, а затем клеток, представляющих эмбриональную (бластодерма) и три экстраэмбриональных фракции — перидерму (клеточную оболочку), перибласт (желточный синцитий) и желточный мешок (Morgan, 1895; Oppenheimer, 1947; Игнатьева, 1979; Trinkaus, 1993). Сегрегация заходит так далеко, что клетки бластодермы не синтезируют собственных аминокислот, а получают их из желточного мешка путем активного транспорта. Из-за этого, в частности, изолированная от желтка бластодерма не может жить in vitro в солевом растворе без добавления питательной среды (Trinkaus, Drake, 1956).
Казалось бы, такой (меробластический) тип развития требует строгого соблюдения количественных пропорций эмбрионального и экстраэмбрионального материала, однако у костистых рыб соотношение объема цитоплазмы и желтка варьирует в чрезвычайно широких пределах. У лосося
объем бластодиска составляет 1/30, у хариуса — 1/25, сига — 1/8, ряпушки — 1/4, снетка — 1/3 объема желтка. Его увеличение всегда ведет к смещению формирования зародышевого кольца (ЗК) и закладки зародышевого щитка (ЗЩ) на более ранние стадии эпиболии — у лосося и форели ЗК и ЗЩ возникают, когда бластодерма покрывает 1/10— 1/15 часть яйца, а у снетка — практически в момент завершения обрастания желтка (Мешков, Лебедева, 1977). При этом создается впечатление, что ответ на изменение соотношения объемов бласто-диска и желтка детерминирован не только на генетическом, но и на эпигенетическом уровне, являясь следствием геометрии и механики самого морфогенеза (Черданцева, Черданцев, 1985; Черданцев, 2003).
На эту мысль, в частности, наводят опыты с удалением или, наоборот, инъекцией небольшого количества желтка в желточный мешок зародышей вьюна, так как уменьшение относительного объема желтка ускоряет, а увеличение замедляет эпибо-
лию (Корвин-Павловская и др., 1996, 2006; Слепцова и др., 2004). В этих опытах получается примерно такая же связь между уменьшением доли свободной от желтка цитоплазмы и сдвигом формирования ЗЩ на более ранние стадии эпиболии, какую мы наблюдаем на сравнительно-морфологическом уровне. Наконец, то же самое можно наблюдать, анализируя нормальную индивидуальную изменчивость морфогенеза вьюна (Неклюдова и др., 2007; Черданцев, неопубликованные наблюдения).
О том, что такая связь детерминирована на эпигенетическом уровне, можно говорить потому, что у костистых рыб эпиболия связана с пространственно-временным чередованием фаз утолщения и растяжения краевой зоны бластодермы. Задержка эпиболии в любой данной области делает ее центром конвергенции клеток, мигрирующих в краевую зону, что создает условия для формирования ЗЩ (Cherdantseva, Cherdantsev, 2006).
Это объясняет, каким образом (по крайней мере, в принципе) морфогенез бластодермы костистых рыб отвечает на уменьшение ее относительного объема, но вопрос, каким образом регулируется (и регулируется ли вообще) относительный объем цитоплазмы бластодиска до полной сегрегации эмбрионального и экстраэмбрионального материала, остается открытым. Начиная с классической работы Моргана (Morgan, 1895) на Fundulus heteroclitus, в многочисленных опытах было показано, что при удалении бластомеров на ранних стадиях дробления относительный объем бластодермы уменьшается, что, однако, мало препятствует формированию нормальных эмбриональных структур (Lewis, 1912; Hoadley, 1928; Nicholas, Oppenheimer, 1942; Oppenheimer, 1947). Единственным исключением являются опыты на золотой рыбке, в которых при удалении одного из первых двух бластомеров иногда развивались зародыши, лишенные осевых структур (Tung, Tung, 1944). У вьюна при удалении содержимого одного из первых двух бластомеров возможна полная регуляция развития (Корж, 1981).
Во всех этих опытах авторы фиксировали лишь их результат — наличие или отсутствие регуляции — почти не обращая внимания на то, какими путями он достигался. При отсутствии не только количественных данных, но и простых наблюдений за тем, что происходит непосредственно после операции, остается неясным, пытается ли зародыш восстановить исходный объем свободной от желтка цитоплазмы или же дальнейший морфогенез приспособляется к его новому, уменьшенному объему.
Ответ на этот вопрос является основной задачей этой работы. Первоначально мы предполагали, что при удалении цитоплазмы бластомеров относительный объем бластодермы уменьшится
очень сильно и регуляция будет состоять в изменении структуры морфогенетических движений клеток бластодермы применительно к новым условиям. Оказалось, однако, что регуляция является двухфазным процессом. В первой, относительно быстрой фазе, занимающей всего несколько первых циклов дробления, зародыш восстанавливает объем свободной от желтка цитоплазмы, близкий к ее исходному объему. Во второй, более медленной фазе, морфогенез адаптируется к изменению формы бластодермы, возникающему из-за перераспределения цитоплазмы между эмбриональной фракцией клеток и экстраэмбриональными фракциями зародыша. Двухфазный характер регуляции иллюстрирует общий принцип, согласно которому регуляция включает в себя не только возвращение на исходный путь развития, но и движение к одному и тому же результату разными путями (Черданцев, 2003).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Половые продукты самцов и самок вьюна Ы1з-gurnusfossilis Ь. получали с помощью стандартной методики (Костомарова, 1975). После оплодотворения развитие икры до необходимой стадии проходило в отстоянной прокипяченной воде при температуре от 18 до 21°С. Для проведения операций зародышей помещали в чашку Петри с 5 мл 1х раствора Гольтфретера. Экспериментальные манипуляции с зародышами проводили без их извлечения из желточной оболочки, ограничиваясь ее проколом над местом операции.
Цитоплазматический материал удаляли с помощью микроинъектора, имеющего в своей конструкции микровинт, регулирующий положение подпружиненного поршня, который, в свою очередь, ходит в заполненном водой шприце, согласно методике, описанной ранее (Слепцова и др., 1990б, 2004; Корвин-Павловская и др., 1996). Диаметр использованных в опыте микропипеток подбирали в соответствии с размером бластомеров, от 20 до 90 мкм.
Цитоплазму отсасывали до тех пор, пока бла-стомер не переставал выделяться над поверхностью желточной клетки. При этом допускалось удаление некоторого количества желтка. При операциях на стадиях 8-ми и 16-ти бластомеров клетки удаляли целиком, вместе с мембраной. Эксперименты проводили в следующих вариантах: удаление большей части цитоплазматического материала одной клетки на стадиях 2-х (серия 2) и 4-х бластомеров (серия 4), а также удаление одной краевой клетки на стадиях 8-ми (серия 8) и 16-и бластомеров (серия 16). Через 30 минут после операции зародышей переносили в отстоянную кипяченую воду.
Выживаемость в разных вариантах опыта (см. пояснения в тексте)
Вариант опыта Всего зародышей Кол-во зародышей, достигших стадии бластулы Кол-во зародышей, достигших стадии личинки
2 175 117 (67%) 55 (31%)
4 225 191 (85%) 148 (66%)
8 70 61 (87%) 45 (64%)
16 35 32 (91%) 20 (57%)
контроль 244 234 (96%) 213 (87%)
Во всех экспериментальных сериях в качестве контроля использовали икру той же кладки, что и в соответствующем опыте.
0.3
0.2
А
0.1
0.3
I I I. 1
О А 1
Опыт 2 Опыт 4 Опыт 8 Опыт 16 Контроль • Эмпирические значения А Значения, рассчитанные при условии отсутствия регуляции
Б
0.2
0.1
40 80 120 160 200 240 280 320 360 Время после оплодотворения, минуты
Опыт 2 * ^ Опыт 4 Контроль
Рис. 1. Восстановление исходного соотношения объемов бластодиска и желтка в опытах с удалением цито-плазматического материала бластомеров: А— отношение объемов бластодермы и всего зародыша на стадии высокой бластулы в разных вариантах опыта (опыт 2, n = 31; опыт 4, n = 37; опыт 8, n = 21; опыт 16, n = 24; контроль, n = 36); Б — изменение относительных объемов бластодермы отдельных зародышей в вариантах опыта 2, 4 и контроле (на основе покадрового анализа цейтраферной съемки).
Операции и цейтр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.