АГРОХИМИЯ, 2013, № 9, с. 55-58
Регуляторы роста растений
УДК 631.811.98:581.143.6:57.085.2
МОРФОГЕНЕЗ HEDYSARUM ARGYROPHYLLUM LEDEB.
В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
© 2013 г. А.Ш. Ахметова
Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН 450080 Уфа, Башкортостан, Россия E-mail: al_sham@mail.ru
Поступила в редакцию 02.11.2012 г.
Показана возможность эффективного применения метода культуры тканей для микроклонального размножения копеечника серебристолистного Hedysarum argyrophyllum Ledeb. in vitro. Получен прямой морфогенез c использованием семядольных узлов, фрагментированных из стерильных проростков. Разработаны оптимальные среды для побегообразования и ризогенеза. Максимальная частота регенерации была получена на питательных средах, содержащих 2.0 мг/л БАП и 0.1 мг/л ИУК. Хорошо развитые и укорененные растения-регенеранты успешно адаптировались к естественным условиям окружающей среды.
Ключевые слова: морфогенез, Hedysarum argyrophyllum Ledeb., in vitro, регенерация, размножение.
ВВЕДЕНИЕ
Копеечник серебристолистный Hedysarum argyrophyllum Ledeb. - редкий декоративный вид, занесенный в ряд региональных Красных Книг Российской Федерации [1, 2]; эндемичен для Башкортостана, известен для 23 изолированных, по преимуществу скальных, местонахождений и находится под угрозой исчезновения. Численность растений H. argyrophyllum значительно меняется по годам и составляет от нескольких десятков до 1200 экз. генеративных особей. Причиной резкого снижения численности в неблагоприятные годы является гибель семенного потомства всех возрастных групп. Учитывая возможность повреждения значительного количества взрослых особей при выпасе скота, степных пожарах, разработке известняка, рекреационном воздействии, представляется необходимым, помимо охраны популяции H. argyrophyllum in situ, сохранение вида путем интродукции с последующим созданием искусственных интродукционных популяций за пределами современного ареала. Поэтому разработка альтернативных способов расширения сырьевой базы H. argyrophyllum весьма актуальна. Чрезвычайно важно и то, что такая разработка дает уникальную возможность сохранить природные популяции H. argyrophyllum и способствует сохранению многообразия растительного мира.
Проблема сохранения H. argyrophyllum in situ может быть решена путем введения этого расте-
ния в культуру тканей, создания генных банков и репатриацией полученного в ходе микроклонального размножения материала в естественные сообщества. При выборе стратегии сохранения биоразнообразия редких, исчезающих видов растений многими исследователями показана эффективность методов биотехнологии в сравнении с традиционными способами их размножения [3-5].
Работ по получению регенерации адвентивных проростков in vitro из эксплантов H. argyrophyllum мало. В работе [6] еще в 1974 г. изучали влияние ряда фитогормонов (кинетина, ИУК, гибберелина) на регенерацию из черенков H. argyrophyllum. В исследованиях [7, 8] смогли получить каллус H. argyrophyllum из эксплантов корней с аномальными проростками, но при этом их количество было очень незначительным. Исследовали также влияние ауксинов и цитокининов на формирование адвентивных проростков у эксплантов сеянцев H. grandiflora Pall [9]. Работы по получению адвентивного органогенеза из семядольных узлов стерильных проростков H. argyrophyllum, по данным авторов, отсутствуют.
Цель работы - разработка и оптимизация способа размножения in vitro H. argyrophyllum для получения массового посадочного материала и возможности создания высокопродуктивных популяций.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Одним из ключевых моментов создания коллекции in vitro является разработка приемов введения растительного материала в стерильную культуру, что предусматривает как выбор экспланта, так и подбор условий стерилизации. При изучении асептических линий в качестве исходного материала использовали семена H. argyrophyllum, собранные с растений в местах их естественного произрастания. Работу в асептических условиях, стерилизацию питательных сред и посадочного материала проводили согласно имеющимся рекомендациям [10-12].
Поверхностную стерилизацию семян проводили с использованием в качестве стерилизующих агентов: ртутьсодержащего соединения -0.1%-ного диацида и 1.0%-ного лизоформина. Семена стерилизовали в 70%-ном этаноле, затем в одном из стерилизующих растворов (всего 3 варианта обработки). Использованные авторами стерилизующие растворы по-разному влияли на жизнеспособность семян и последующее развитие проростков. Экспозиция воздействия стерилизующих растворов составляла от 4 до 12 мин (табл. 1).
Применение лизоформина для стерилизации семян не являлось оптимальным, т. к. в этом случае получение стерильной культуры составляло всего 12-31% независимо от экспозиции стерилизации. Причем при 12-минутном выдерживании семян в лизоформине число инфицированных семян было максимальным и составляло 70-88%. При стерилизации семян в 0.1%-ном растворе диаци-да в течение 8 мин было получено максимальное количество стерильной культуры (83%), которое характеризовалось интенсивным ростом.
С целью изучения процесса прорастания семена H. argyrophyllum помещали на безгормональную среду, содержащую минеральные соли по прописи MSO. Семена проращивали при температуре 26°С, влажности воздуха не менее 70%, 16-часовом фотопериоде и световой интенсивности 2-3 тыс. лк (белые флуоресцентные лампы).
Через 4 нед культивирования использовали семядольные узлы проростков H. argyrophyllum, которые субкультивировали на модифицированные среды Мурасиге и Скуга (MS) [13].
Для инициации морфогенетических процессов использовали модифицированные среды, различающиеся по типу и концентрации цитокининов: 6-бензиламинопурина (6-БАП), кинетина, а также ауксина: индолилуксусной кислоты (ИУК). Всего в исследовании было испытано 4 варианта питательных сред. Средняя продолжительность пассажа составляла 4 нед.
Таблица 1. Влияние стерилизующего раствора и его экспозиции на получение стерильных культур Н. аг^угоркуПыш, %
Стерилизующий раствор
0.1%-ный диацид
1.0%-ный лизоформин
экспозиция стерилизации, мин
4 6 8 6 10 12
12.5±4.5 42.6±6.7 83.3±5.4 12.2±4.7 20.4±5.8 30.6±6.6
Совместное использование цитокининов и ауксинов способствовало вытягиванию конуса нарастания, что позволило в дальнейшем проводить микрочеренкование регенерантов. Повышение содержания цитокинина привело к появлению множества пазушных побегов. Таким образом, микроразмножение происходило путем активации пазушных меристем, что является предпочтительным для размножения редких видов, поскольку позволяет поддерживать генетическую стабильность размножаемых растений [14].
После культивирования эксплантов в течение 4 нед учитывали регенерационную способность эксплантов (отношение эксплантов, образующих регенеранты, к их общему числу, %).
Средние величины показателей определяли для каждого эксперимента отдельно, затем определяли средние для всех экспериментов. В каждом опыте для регенерационной способности экс-плантов использовали 30 пробирок. В таблицах приведены средние из 2-х опытов и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выявлено, что за первые 5 сут у Н. ащугоркуНыш прорастало 22% семян. Затем скорость прорастания снижалась, и на 15-е сут прорастало всего 10% семян. Далее энергия прорастания резко возрастала, достигая 40% всхожести семян.
Интенсивность морфогенеза зависит от наличия регуляторов роста, использованных в питательной среде. Одним из наиболее мощных индукторов морфогенеза, который принято называть стимулирующим фактором или сигналом морфогенеза, является изменение соотношения между цитокининами и ауксинами, входящими в состав питательных сред [15]. Поэтому следующим этапом работы было изучение влияния соотношения экзогенных регуляторов роста на процесс морфогенеза (табл. 2).
Культивирование эксплантов Н. ащугоркуНыш во всех вариантах питательной среды приводило
MОРФОГEHEЗ HEDYSARUM ARGYROPHYLLUM LEDEB. В КУЛЬТЕРЕ IN VITRO
57
Таблица 2. Зависимость морфогенеза H. argyrophyllum in vitro от концентрации регуляторов роста
Вариант среды (регуляторы роста, мг/л) Доля эксплантов, % Длина побега, мм
некро-тизиро-ванных* с диффе-ренциро-ванной тканью*
Кинетин 0.5 + ИУК 0.2 БAП 0.5 + ИУК 0.2 БAП 1.0 БAП 2.0 + ИУК 0.1 б9.8±0.3 71.1±0.2 б0.9±0.5 39.9±0.1 30.2±0.2 28.9±0.2 39.1±0.2 б0.1±0.3 5.4±2.1 4.1±1.5 4.4±1.5 12.3±1.8
* Среднее для 30 измерений.
Индукция развития побегов H. argyrophyllum на питательной среде MS, содержащей БАП 2.0 мг/л + ИУК 0.1 мг/л.
к индукции морфогенеза, который выражался в дифференциации меристематических очагов непосредственно на экспланте. Следует отметить, что в варианте 3 (БАП 1.0 мг/л), где наблюдали прямую регенерацию растений, образование ме-ристематических зон и формирование микропобегов нередко сопровождалось образованием вит-рифицированных тканей, которые ингибировали дальнейший рост дифференцированных частей побегов H. argyrophyllum. В варианте 1 (кинетин 0.5 мг/л + ИУК 0.2 мг/л), где началу морфогенеза H. argyrophyllum сопутствовал процесс каллусо-генеза, как правило, число адвентивных почек не превышало в среднем 5.2 шт. Комбинация регуляторов роста БАП 2.0 мг/л + ИУК 0.1 мг/л способствовала формированию множества пазушных побегов. Средняя длина побега (12.3 мм), среднее число узлов существенно превышали величины этих показателей на других средах (табл. 2, вариант 4).
Таким образом, показано преимущество использования питательной среды, содержащей БАП 2.0 мг/л + ИУК 0.1 мг/л, которая позволила получить 60% эксплантов с дифференцированной тканью. При этом коэффициент размножения побегов через 8 нед культивирования эксплантов составил 3-5 (рисунок).
Проведенные исследования дали возможность оценить метод клонального микроразмножения, позволивший депонировать H. argyrophyllum как материал для размножения посадочного материала.
Микроразмножение H. argyrophyllum происходило путем активации пазушных меристем. Оптимальной для формирования микропобегов с коэффициентом размножения 3-5 являлась питательная среда MS, содержащая БАП 2.0 мг/л + + ИУК 0.1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.