НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 2, с. 147-151
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 615.214.32.577.175.82.(0.15.4)612.822
МОРФОХИМИЧЕСКАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ МОЗГА: ЭФФЕКТ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ L-ДОФА
© 2004 г. Н. Н. Боголепов, Е. Л. Доведова*, Л. М. Герштейн
ГУ НИИ мозга РАМН, Москва
Изучали активность ферментов нейромедиаторного обмена, содержание белков, биогенных аминов и их метаболитов на субклеточном уровне в структурах моторной коры и хвостатого ядра мозга кроликов и крыс под влиянием пептида дельта-сна (ДСИП) введенного системно в дозе 60 мкг/кг массы тела на фоне воздействия дезоксифенилэтиламина (L-ДОФА) в течение 30 дней. Обнаружен нормализующий эффект ДСИП на исследуемые показатели, отражающий коррекцию вызванной L-ДОФА повышенной активности дофаминергической системы (МАО Б, ДА, ГВК), и усиление реакции серотонинергической системы (МАО А, 5-ОИУК). Выявлены различия в ответной реакции на экспериментальное воздействие со стороны отдельных типов нейронов и их субклеточных компонентов.
Высказано предположение, что действие ДСИП опосредовано перестройкой нейрональных беков и взаимодействием нейромедиаторных систем в мозге, которые могут лежать в основе механизма морфохимической пластичности мозга и обеспечивать адаптивное поведение животных.
Ключевые слова: мозг, нейромедиаторы, L-ДОФА, ДСИП.
В течение ряда лет при моделировании нарушений структуры и метаболизма мозга экспериментальных животных проводятся комплексные исследования с использованием эндогенных биологически активных веществ, среди которых особое значение приобрели короткие, так называемые регуляторные, олигопептиды [1-3].
Фармакологическая коррекция этих нарушений способствует пониманию пластических и компенсаторных механизмов в функционировании мозга на поведенческом, нейронном и молекулярном уровнях [4 -8].
В настоящее время имеются данные, свидетельствующие о тесных связях регуляторных пептидов с различными медиаторными системами в центральной и периферической нервных системах. Получены сведения о влиянии пептидов на активность некоторых ферментных систем, участвующих в метаболизме медиаторов в мозге [9, 10].
Из известных регуляторных пептидов дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП) оказывает существенное влияние на многие физиологические функции, способствуя приспособительным реакциям у животных. Действие ДСИП во многом зависит от состояния организма. Так, введение пептида при агрессивно-оборонительной реакции животных приводит к изменению активности ряда подкорковых структур, участвующих в регуляции сна. На фоне психомоторного возбуждения
*Адресат для корреспонденции: 105064 Москва, пер. Обуха, д. 5; тел.: 916-34-72; факс: 916 05 95; e-mail: xaa@pisemnet.ru
(при введении Ь-ДОФА) пептид вызывает нормализацию поведения и показателей ЭЭГ [11-13].
На основании обобщения и анализа биохимических и цитохимических данных, полученных нами на различных экспериментальных моделях [14-16] была выдвинута концепция о функционально обусловленной биохимической гетерогенности нейронов и их субклеточных компонентов, которая формируется в процессе онтогенеза по мере становления функций ЦНС и проявляется при компенсаторно-восстановительных процессах в условиях нарушенной жизнедеятельности организма. Установлено, что функционально обусловленная морфохимическая гетерогенность проявляется: 1) в образованиях мозга, входящих в одну функциональную систему (двигательная, зрительная), в том числе и в отдельных областях коры больших полушарий; 2) в нейронах различных морфофункциональных типов (ассоциативных, афферентных, эфферентно-проекционных); 3) в отдельных компонентах нейрона (ядро и цитоплазма) и его субклеточных органеллах (синапто-сомах, мембранах синаптосом).
В настоящем сообщении положение о многоуровневой морфохимической организации мозга будет подтверждено экспериментальными данными, полученными на модели гиперфункции до-фаминергической системы, создаваемой при введении дезоксифенилэтиламина (Ь-ДОФА) - предшественника дофамина (ДА) с последующей коррекцией вызванных изменений с помощью одного из регуляторных пептидов (ДСИП).
147
5*
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве тестов, адекватно отражающих изменения функционального состояния ЦНС, были взяты показатели обмена нейромедиаторов и белков, которые позволили рассматривать процессы адаптации и компенсации с биохимических позиций.
Экспериментальными животными служили крысы линии Вистар и кролики породы шиншилла, которым внутрибрюшинно вводили препарат "Мадопар-125" в дозе 25.5 мг на 1 кг массы тела, что соответствует 50 мг/кг L-ДОФА. Препарат использовали однократно или длительно в течение 3 или 30 дней (суммарная доза 0.18 и 1.5 г на 1 кг массы тела). Контрольным животным вводили физиологический раствор.
Через 60 мин после однократной инъекции L-ДОФА животным обеих групп (крысам - внутримышечно, кроликам - субокципитально) вводили ДСИП1 из расчета соответственно 60 и 30 мкг на 1 кг массы тела и через 30 мин животных декапитировали. Объектом исследования служили субфракции "легких" и "тяжелых" си-наптосом и свободных митохондрий сенсомотор-ной области коры и хвостатого ядра мозга крыс и кроликов.
Ткань мозга (моторная кора - 400 мг, хвостатое ядро - 80 мг) гомогенизировали в среде выделения (0.32 М сахароза, 0.001 М Трис-НС1 буфер рН 7.4) в соотношении 1 : 9 (W : V). Из гомогената методом дифференционального центрифугирования после удаления ядер при 1000 х g (15 мин) и промывания изолировали фракцию митохондрий при 10000 х g (20 мин) с содержанием белка в обоих исследуемых образованиях 48.0-55 мг/г ткани мозга.
Моноаминоксидазу А (МАО А) определяли спектрофотометрически по методу Попова и со-авт. [17]. В качестве субстрата использовали серо-тонин креатинин-сульфат (Sigma). Основу метода составляет реакция с семикарбазидом и продуктом окислительного дезаминирования субстрата, протекающая с образованием 5-оксииндолацетальде-нидсемикарбазона, имеющего максимум поглощения при 250 нм. Оптическую плотность продукта измеряли на спектрофотометре Gilford-250 при 250 нм. Удельную ферментативную активность выражали в изменении экстинкции Д£25о за 60 мин в пересчете на мг белка.
Моноаминоксидазу Б (МАО Б) определяли спектрофотометрически по методу Горкина с со-авт. [18]. В качестве субстрата использовали па-ра-нитрофенилэтиламин, образующий при окис-
1 ДСИП синтезирован в Институте биоорганической химии им. Овчиникова А.А. и Шемякина М.М. РАН, за что приносим благодарность научным сотрудникам Михалевой И.И. и Прудченко И.А.
лительном дезаминировании окрашенное соединение с максимумом поглощения при 450 нм. Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (0.1 мл) в опытные и контрольные пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С. По истечении времени инкубации пробирки помещали в лед и измеряли экстинкцию на спектрофотометре Gilford-250. Удельную ферментативную активность выражали в изменении оптической плотности ДЕ250 за 60 мин в пересчете на мг белка.
Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) определяли по методу Hestrin [19]. Принцип метода основан на образовании окрашенного продукта в результате 2-ступенчатой реакции ацетилхолина (АХ) с гидроксиламином при рН 7.8 с образованием холина и ацетилгидроксамовой кислоты, которая затем с хлорным железом (FeC13) образует комплексное соединение, определяемое спектрофотометрически при 540 нм. Активность АХЭ выражали в мкмолях АХ, оценивая ее по убыли субстрата. Для ингибирования неспецифических холинэстераз применялся диизопропилфторфос-фат в конечной концентрации 10-5 М.
Содержание биогенных аминов определяли флуориметрически по методу Когана и соавт. [20]. Навеску ткани (кора - 150 мг, хвостатое ядро -40 мг) гомогенизировали в Н2О (1.5 мл) с добавлением 3 мл подкисленного бутанола, насыщенного NaCl. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 1000 х g. К 0.5 мл 1%-ного раствора солянокислого цистеина, приготовленного на 0.1 М HCl добавляли 5 мл гептана и 2.5 мл надосадочной жидкости. Смесь встряхивали в течение 5 мин. Далее неорганическую фазу использовали для определения дофамина (ДА), норадреналина (НА) и серотонина (5-ОТ).
Для определения ДА и НА проводили прямое (опыт) и обратное (контроль) окисление. Флуоресценцию НА измеряли при 380 (ex) и 478 (em) нм, ДА - при 330 (ex) и 420 (em) нм на спектрофлуори-метре Hitachi MPF-4.
Для определения серотонина смешивали 0.2 мл неорганической фазы и 0.3 мл ортофталевого ди-альдегида, помещали в кипящую водяную баню на 6 мин, охлаждали на льду и измеряли флуоресценцию при 370 (ex) и 470 (em) нм. В качестве контроля вместо неорганической фазы использовали 0.2 мл 1%-ного раствора солянокислого цистеина, приготовленного на 0.1 М HCl.
Для определения 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) к 6 мл органической фазы приливали 0.4 мл солянокислого цистеина 1%-ного раствора в 0.5 М фосфатном буфере рН 7.4. Встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали при 1000 х g в течение 5 мин, отбирали 0.15 мл неорганической фазы, добавляли 0.35 мл раствора ортофталевого диальдегида. Дальнейшую обработку и измерение проводили как и для 5-ОТ. В каче-
% I II III
Рис. 1. Влияние L-ДОФА на активность ферментов (100%) МАО А (I), МАО Б (II) и АХЭ (III) в сенсомо-торной коре (а) и хвостатом ядре (•). Белые столбики - L-ДОФА (60 мин), заштрихованные - L-ДОФА (хронич.). А - синаптосомы (легкие); Б - синаптосомы (тяжелые); В - митохондрии; Г -мембраны. * -p < 0.05.
стве контроля вместо неорганической фазы использовали 0.15 мл 1%-ного солянокислого ци-стеина, приготовленного на 0.5 М фосфатном буфере рН 7.4.
Часть материала фиксировали в жидкости Карнуа, проводили по спиртам (100%-ный этанол; смесь этанола с хлороформом, смесь хлороформа с парафином) и заключали в парафин; изготавливали срезы толщиной 7 мкм. На неокрашенных срезах измеряли профильное поле нейронов с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15. Интерфе-рометрически на микроскопе ИНТЕРФАКО (Германия) в монохромотическом свете при длине волны 560 нм определяли сухую массу плотных веществ, что на фиксированном материале отражает содержание структурированных белков в нейронах сенсомоторн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.