ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 2, с. 110-114
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН AINTEGUMENTA РАПСА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА
© 2013 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, А. В. Чемерис, В. А. Вахитов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, ул. Проспект Октября, д. 71 E-mail: kuluev@bk.ru Поступила в редакцию 26.04.12 г. Окончательный вариант получен 25.10.12 г.
Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген AINTEGUMENTA рапса под контролем 35S промотора и промотора вируса мозаики георгина. Трансгенные растения характеризовались увеличением длины листьев, размеров цветка, высоты стебля и массы семян, причем степень увеличения была больше в случае использования в качестве регулятора транскрипции промотора вируса мозаики георгина. Эктопическая экспрессия гена AINTEGUMENTA способствовала пролонгации роста листьев, при этом размеры клеток эпидермиса листьев оставались неизменными.
Ключевые слова: размеры органов, AINTEGUMENTA, трансгенные растения, Brassica napus, Nicotiana tabacum.
DOI: 10.7868/S0475145013020080
ВВЕДЕНИЕ
Создание трансгенных растений с увеличенными размерами органов представляет большой интерес для сельского и лесного хозяйств. Одним из перспективных методов получения таких растений являются манипуляции с уровнем экспрессии различных транскрипционных факторов, участвующих в регуляции роста и развития растений. Ген AINTEGUMENTA (ANT) кодирует тран-скрипционныруй фактор, относящийся к семейству AP2/ERF, подсемейству АР2, к группе ANT (Kim et al., 2006). Одной из мишеней ANT является ген CYCLIND3;1, который регулирует клеточное деление и способствует поддержанию клеток органа на стадии S (Mizukami, Fischer, 2000). Транскрипция гена ANT стимулируется белком ARGOS, экспрессия которого, в свою очередь, индуцируется ауксином (Hu et al., 2003). Было показано, что трансгенные растения, сверхэкспрес-сирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются несколько большими размерами не только генеративных (Krizek, 1999), но и вегетативных органов (Mizukami, Fischer, 2000). У рапса обнаружены два гена-кандидата ANT с названиями BnaX.ANT.a (DQ211969) и BnaX.ANT.b (DQ211970) (Chen et al., 2010). Исходя из литературных данных следует, что повышение уровня экспрессии гена ANT вполне может стать одним из методов создания трансгенных растений с увеличенными размерами листьев, стеблей, цветков, плодов и семян (Mizukami, Fischer, 2000). Для по-
вышения уровня экспрессии целевых генов в трансгенных растениях чаще всего применяют 35S промотор, однако на практике применение данного промотора часто оказывается неэффективным (Mitsuhara et al., 1996). В связи с этим, нами ранее был выделен промотор вируса мозаики георгина (ВМГ), который в трансгенных растениях табака оказался немного сильнее 35S промотора (Кулуев и др., 2010). В данной работе с целью получения трансгенных растений с увеличенными размерами органов нами был использован полноразмерный ген ANT рапса, а именно BnaX.ANT.b, в сочетании как с 35S промотором, так и с промотором вируса мозаики георгина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Участок ДНК, содержащий ген BnaX.ANT.b, был амплифицирован из геномной ДНК рапса при помощи праймеров ANTRapF ACAATG-
CAAGAATCAGCCCAAGCAG. Затем ген BnaX.ANT.b выщепили из вектора pKRX по сайту BsePI и осуществили его ненаправленное клонирование в бинарных векторах pCambia 2201 с 35S промотором и pCambia 2301 (CAMBIA, Австралия) с промотором вируса мозаики георгина (Кулуев и др., 2011). Для поиска целевых клонов содержащих ген BnaX.ANT.b в смысловой ориентации при лигировании в векторе pCambia 2201, использовали праймер 35SCambF: AGAGGAC-
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ ТАБАКА
111
(а)
«
polyA
NPTII
35S Ц ВМГ
BnaX.ANT.b к
polyA ) 35S
GUS
polyA
>
(б)
BnaX.ANT.b
а-тубулин
Рис. 1. а — Генно-инженерная конструкция Т-ДНК бинарного вектора pCambia 2301, состоящая из селективного и ре-портерного генов, а также целевого гена BnaX.ANT.b под контролем промотора вируса мозаики георгина. 35S — 35S промотор; ВМГ — промотор вируса мозаики георгина; NPTII — ген неомицинфосфотрансферазы II; GUS — ген ß-глю-куронидазы; polyA — сайт полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты. б — Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР гена BnaX.ANT.b в исследуемых линиях трансгенных растений: 1 — контрольное растение; 2 — трансгенное растение линии 2201/BnANT № 21; 3 — трансгенное растение линии 2201/BnANT № 23; 4 — трансгенное растение линии 2301/BnANT № 67.
CTAACAGAACTCG, а при лигировании в векторе pCambia 2301 использовали праймер DMVF ATCAACGGAGAAACAAAGAT. После полной проверки, полученные в ходе работы две генно-инженерные конструкции с геном BnaX.ANT.b под контролем 35S промотора и промотора ВМГ (рис. 1а) были введены в клетки A. tumefaciens.
Трансгенные формы табака (Nicotiana taba-cum L. Petit Havana SR-1) получали методом агро-бактериальной трансформации листовых дисков (Кулуев и др., 2011). Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом (Гера, Россия) на свето-площадке при температуре 26°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 клк. Проростки выращивали в течение 20-ти дней на агаризованной среде МС, затем определяли длину гипокотиля и корешков и пересаживали их на почву. Замеры величины листьев производили только после пересадки в почву, через 30, 45 дней и в период цветения, в итоге было осуществлено 3 замера. По каждому варианту было отобрано по 5 растений, у которых определяли среднюю длину, площадь трех нижних листьев и высоту стебля. Отмечали время перехода к цветению, определяли длину цветка, начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика. Измеряли длину 3-х цветков с каждого растения начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика и вычисляли среднее значение. У трансгенных растений собирали семена, распределяли их по 30 штук, измеряли их массы и определяли среднее значение, при этом выборка состояла из 10-ти групп семян. Для изучения вли-
яния конститутивной экспрессии целевого гена на размеры клеток, проводили измерения площади клеток нижнего эпидермиса листьев одного возраста при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия). В качестве контроля использовали трансгенные растения табака, трансформированные Т-ДНК бинарного вектора pCambia 2301 без вставки целевого гена. Для ОТ-ПЦР гена BnaX.ANT.b использовали праймеры GTTTCTCTAGGGGTGCTTCCATCT и AGCG-GTTTCCTCGTCGTTATTGT. Для ОТ-ПЦР мРНК гена, кодирующего а-тубулин табака использовали праймеры tubAF CAAGGTG-CAAAGGGCTGTATGTATGA и tubAR GCAC-CAACTTCCTCGTAATCCTTTTC.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Целевой генно-инженерной конструкцией гена BnaX.ANT.b в векторе pCambia 2201 были проведены две агробактериальные трансформации листовых дисков табака и на селективной среде отобрано 90 первичных трансформантов. Из них укоренились на среде МС с канамицином 12 растений, из которых лишь три показали активность репортерного гена GUS в листьях. Эти три растения были акклиматизированы к условиям почвы, доведены до цветения с целью получения семян. Таким образом, были получены три линии трансгенных растений с номерами 11, 21 и 23. Из этих отобранных растений табака была выделена геномная ДНК и проведен ПЦР-анализ на наличие гена BnaX.ANT.b и 35S промотора. Было показано, что все три растения содержат в своем геноме как целевой ген, так и 35S промотор.
112
КУЛУЕВ и др.
Морфологические параметры контрольной группы, содержащей Т-ДНК бинарного вектора рСашЫа 2301 и трансгенных растений табака поколения Тх, экспрессирующих ген ВпаХ.ЛЫТ.Ъ рапса
Параметр Линия контрольных растений Линии трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ВпаХ.ЛЫТ.Ъ
рСашЫа 2301 2201/ВпЛЭТ № 21 2201/ВпЛЭТ № 23 2301/ВпЛЭТ № 67
Длина листьев, см
через 30 дней 3.9 ± 0.3 4.8 ± 0.2 3.4 ± 0.1 3.0 ± 0.1
через 45 дней 9.1 ± 0.8 9.9 ± 0.2 9.4 ± 0.2 9.1 ± 0.4
В период цветения 15.7 ± 0.7 18.2 ± 0.5 17.9 ± 0.5 19.6 ± 0.3
Средняя площадь трех нижних листьев, см2 137 ± 10 143 ± 5 143 ± 10 151 ± 4
Площадь клеток эпидермиса листьев, мкм2 18271±624 17029 ± 620 14609 ±515 19564 ± 135
Высота стебля, см 82.5 ± 1.9 103.3 ± 4.5 98.0 ± 6.2 110.7 ± 4.3
Длина цветка, см 4.46 ± 0.02 4.74 ± 0.05 4.75 ± 0.04 4.85 ± 0.09
Длина корней через 20 дней после посева на среду МС, см 1.10 ± 0.06 1.20 ± 0.11 1.03 ± 0.09 1.70 ± 0.12
Длина гипокотилей через 20 дней после посева на среду МС, мм 1.8 ± 0.1 2.0 ± 0.2 1.6 ± 0.1 2.8 ± 0.2
Масса 30-ти семян, г 1.6 ± 0.2 1.9 ± 0.2 1.8 ± 0.2 2.3 ± 0.4
В ходе агробактериальной трансформации табака конструкцией гена ВпаХ.ЛЫТ.Ъ в векторе рСашЫа 2301 на селективной среде было отобрано 67 первичных побегов. Из них 6 трансформантов укоренилось на среде с канамицином, при этом лишь последнее во всей группе растение под номером 67 показало высокую активность репор-терного гена Данное растение было доведено до цветения, а семена были отобраны для дальнейшей работы.
Семена трех линий трансгенных растений 2201/ВпЛМТ второго поколения были высеяны на селективную среду, где только растения линий № 21 и 23 показали классическое соотношение выживших и погибших 3 : 1, что косвенно предполагает наличие единичной копии встроенного трансгена. Семена трансгенных растений рСашЫа 2301/ВпЛМТ № 67 на селективной среде МС также показали расщепление 3 : 1. По длине корня и гипокотиля между опытными и контрольными растениями разница была обнаружена лишь для линии № 67, причем было отмечено их удлинение на 55 и 56% соответственно (таблица). Далее по 5 растений трех отобранных линий № 21, 23 и 67 были акклиматизированы к условиям почвы для проведения дальнейших экспериментов по их морфологической характеристике. В качестве контроля использовали линию трансгенных
растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора рСашЫа 2301 без целевого гена. Через 30 и 45 дней после акклимат
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.