научная статья по теме МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН AINTEGUMENTA РАПСА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА Биология

Текст научной статьи на тему «МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН AINTEGUMENTA РАПСА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА»

ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 2, с. 110-114

= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1:577.214.625:578.853

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН AINTEGUMENTA РАПСА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА

© 2013 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, А. В. Чемерис, В. А. Вахитов

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, ул. Проспект Октября, д. 71 E-mail: kuluev@bk.ru Поступила в редакцию 26.04.12 г. Окончательный вариант получен 25.10.12 г.

Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген AINTEGUMENTA рапса под контролем 35S промотора и промотора вируса мозаики георгина. Трансгенные растения характеризовались увеличением длины листьев, размеров цветка, высоты стебля и массы семян, причем степень увеличения была больше в случае использования в качестве регулятора транскрипции промотора вируса мозаики георгина. Эктопическая экспрессия гена AINTEGUMENTA способствовала пролонгации роста листьев, при этом размеры клеток эпидермиса листьев оставались неизменными.

Ключевые слова: размеры органов, AINTEGUMENTA, трансгенные растения, Brassica napus, Nicotiana tabacum.

DOI: 10.7868/S0475145013020080

ВВЕДЕНИЕ

Создание трансгенных растений с увеличенными размерами органов представляет большой интерес для сельского и лесного хозяйств. Одним из перспективных методов получения таких растений являются манипуляции с уровнем экспрессии различных транскрипционных факторов, участвующих в регуляции роста и развития растений. Ген AINTEGUMENTA (ANT) кодирует тран-скрипционныруй фактор, относящийся к семейству AP2/ERF, подсемейству АР2, к группе ANT (Kim et al., 2006). Одной из мишеней ANT является ген CYCLIND3;1, который регулирует клеточное деление и способствует поддержанию клеток органа на стадии S (Mizukami, Fischer, 2000). Транскрипция гена ANT стимулируется белком ARGOS, экспрессия которого, в свою очередь, индуцируется ауксином (Hu et al., 2003). Было показано, что трансгенные растения, сверхэкспрес-сирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются несколько большими размерами не только генеративных (Krizek, 1999), но и вегетативных органов (Mizukami, Fischer, 2000). У рапса обнаружены два гена-кандидата ANT с названиями BnaX.ANT.a (DQ211969) и BnaX.ANT.b (DQ211970) (Chen et al., 2010). Исходя из литературных данных следует, что повышение уровня экспрессии гена ANT вполне может стать одним из методов создания трансгенных растений с увеличенными размерами листьев, стеблей, цветков, плодов и семян (Mizukami, Fischer, 2000). Для по-

вышения уровня экспрессии целевых генов в трансгенных растениях чаще всего применяют 35S промотор, однако на практике применение данного промотора часто оказывается неэффективным (Mitsuhara et al., 1996). В связи с этим, нами ранее был выделен промотор вируса мозаики георгина (ВМГ), который в трансгенных растениях табака оказался немного сильнее 35S промотора (Кулуев и др., 2010). В данной работе с целью получения трансгенных растений с увеличенными размерами органов нами был использован полноразмерный ген ANT рапса, а именно BnaX.ANT.b, в сочетании как с 35S промотором, так и с промотором вируса мозаики георгина.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Участок ДНК, содержащий ген BnaX.ANT.b, был амплифицирован из геномной ДНК рапса при помощи праймеров ANTRapF ACAATG-

CAAGAATCAGCCCAAGCAG. Затем ген BnaX.ANT.b выщепили из вектора pKRX по сайту BsePI и осуществили его ненаправленное клонирование в бинарных векторах pCambia 2201 с 35S промотором и pCambia 2301 (CAMBIA, Австралия) с промотором вируса мозаики георгина (Кулуев и др., 2011). Для поиска целевых клонов содержащих ген BnaX.ANT.b в смысловой ориентации при лигировании в векторе pCambia 2201, использовали праймер 35SCambF: AGAGGAC-

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ ТАБАКА

111

(а)

«

polyA

NPTII

35S Ц ВМГ

BnaX.ANT.b к

polyA ) 35S

GUS

polyA

>

(б)

BnaX.ANT.b

а-тубулин

Рис. 1. а — Генно-инженерная конструкция Т-ДНК бинарного вектора pCambia 2301, состоящая из селективного и ре-портерного генов, а также целевого гена BnaX.ANT.b под контролем промотора вируса мозаики георгина. 35S — 35S промотор; ВМГ — промотор вируса мозаики георгина; NPTII — ген неомицинфосфотрансферазы II; GUS — ген ß-глю-куронидазы; polyA — сайт полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты. б — Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР гена BnaX.ANT.b в исследуемых линиях трансгенных растений: 1 — контрольное растение; 2 — трансгенное растение линии 2201/BnANT № 21; 3 — трансгенное растение линии 2201/BnANT № 23; 4 — трансгенное растение линии 2301/BnANT № 67.

CTAACAGAACTCG, а при лигировании в векторе pCambia 2301 использовали праймер DMVF ATCAACGGAGAAACAAAGAT. После полной проверки, полученные в ходе работы две генно-инженерные конструкции с геном BnaX.ANT.b под контролем 35S промотора и промотора ВМГ (рис. 1а) были введены в клетки A. tumefaciens.

Трансгенные формы табака (Nicotiana taba-cum L. Petit Havana SR-1) получали методом агро-бактериальной трансформации листовых дисков (Кулуев и др., 2011). Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом (Гера, Россия) на свето-площадке при температуре 26°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 клк. Проростки выращивали в течение 20-ти дней на агаризованной среде МС, затем определяли длину гипокотиля и корешков и пересаживали их на почву. Замеры величины листьев производили только после пересадки в почву, через 30, 45 дней и в период цветения, в итоге было осуществлено 3 замера. По каждому варианту было отобрано по 5 растений, у которых определяли среднюю длину, площадь трех нижних листьев и высоту стебля. Отмечали время перехода к цветению, определяли длину цветка, начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика. Измеряли длину 3-х цветков с каждого растения начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика и вычисляли среднее значение. У трансгенных растений собирали семена, распределяли их по 30 штук, измеряли их массы и определяли среднее значение, при этом выборка состояла из 10-ти групп семян. Для изучения вли-

яния конститутивной экспрессии целевого гена на размеры клеток, проводили измерения площади клеток нижнего эпидермиса листьев одного возраста при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия). В качестве контроля использовали трансгенные растения табака, трансформированные Т-ДНК бинарного вектора pCambia 2301 без вставки целевого гена. Для ОТ-ПЦР гена BnaX.ANT.b использовали праймеры GTTTCTCTAGGGGTGCTTCCATCT и AGCG-GTTTCCTCGTCGTTATTGT. Для ОТ-ПЦР мРНК гена, кодирующего а-тубулин табака использовали праймеры tubAF CAAGGTG-CAAAGGGCTGTATGTATGA и tubAR GCAC-CAACTTCCTCGTAATCCTTTTC.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Целевой генно-инженерной конструкцией гена BnaX.ANT.b в векторе pCambia 2201 были проведены две агробактериальные трансформации листовых дисков табака и на селективной среде отобрано 90 первичных трансформантов. Из них укоренились на среде МС с канамицином 12 растений, из которых лишь три показали активность репортерного гена GUS в листьях. Эти три растения были акклиматизированы к условиям почвы, доведены до цветения с целью получения семян. Таким образом, были получены три линии трансгенных растений с номерами 11, 21 и 23. Из этих отобранных растений табака была выделена геномная ДНК и проведен ПЦР-анализ на наличие гена BnaX.ANT.b и 35S промотора. Было показано, что все три растения содержат в своем геноме как целевой ген, так и 35S промотор.

112

КУЛУЕВ и др.

Морфологические параметры контрольной группы, содержащей Т-ДНК бинарного вектора рСашЫа 2301 и трансгенных растений табака поколения Тх, экспрессирующих ген ВпаХ.ЛЫТ.Ъ рапса

Параметр Линия контрольных растений Линии трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ВпаХ.ЛЫТ.Ъ

рСашЫа 2301 2201/ВпЛЭТ № 21 2201/ВпЛЭТ № 23 2301/ВпЛЭТ № 67

Длина листьев, см

через 30 дней 3.9 ± 0.3 4.8 ± 0.2 3.4 ± 0.1 3.0 ± 0.1

через 45 дней 9.1 ± 0.8 9.9 ± 0.2 9.4 ± 0.2 9.1 ± 0.4

В период цветения 15.7 ± 0.7 18.2 ± 0.5 17.9 ± 0.5 19.6 ± 0.3

Средняя площадь трех нижних листьев, см2 137 ± 10 143 ± 5 143 ± 10 151 ± 4

Площадь клеток эпидермиса листьев, мкм2 18271±624 17029 ± 620 14609 ±515 19564 ± 135

Высота стебля, см 82.5 ± 1.9 103.3 ± 4.5 98.0 ± 6.2 110.7 ± 4.3

Длина цветка, см 4.46 ± 0.02 4.74 ± 0.05 4.75 ± 0.04 4.85 ± 0.09

Длина корней через 20 дней после посева на среду МС, см 1.10 ± 0.06 1.20 ± 0.11 1.03 ± 0.09 1.70 ± 0.12

Длина гипокотилей через 20 дней после посева на среду МС, мм 1.8 ± 0.1 2.0 ± 0.2 1.6 ± 0.1 2.8 ± 0.2

Масса 30-ти семян, г 1.6 ± 0.2 1.9 ± 0.2 1.8 ± 0.2 2.3 ± 0.4

В ходе агробактериальной трансформации табака конструкцией гена ВпаХ.ЛЫТ.Ъ в векторе рСашЫа 2301 на селективной среде было отобрано 67 первичных побегов. Из них 6 трансформантов укоренилось на среде с канамицином, при этом лишь последнее во всей группе растение под номером 67 показало высокую активность репор-терного гена Данное растение было доведено до цветения, а семена были отобраны для дальнейшей работы.

Семена трех линий трансгенных растений 2201/ВпЛМТ второго поколения были высеяны на селективную среду, где только растения линий № 21 и 23 показали классическое соотношение выживших и погибших 3 : 1, что косвенно предполагает наличие единичной копии встроенного трансгена. Семена трансгенных растений рСашЫа 2301/ВпЛМТ № 67 на селективной среде МС также показали расщепление 3 : 1. По длине корня и гипокотиля между опытными и контрольными растениями разница была обнаружена лишь для линии № 67, причем было отмечено их удлинение на 55 и 56% соответственно (таблица). Далее по 5 растений трех отобранных линий № 21, 23 и 67 были акклиматизированы к условиям почвы для проведения дальнейших экспериментов по их морфологической характеристике. В качестве контроля использовали линию трансгенных

растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора рСашЫа 2301 без целевого гена. Через 30 и 45 дней после акклимат

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»