ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 3, с. 166-173
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН PnEXPA3 ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО © 2013 г. Б. Р. Кулуев, М. Г. Сафиуллина, А. В. Князев, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, ул. Проспект Октября, д. 71 E-mail: kuluev@bk.ru Поступила в редакцию 13.02.12 г. Окончательный вариант получен 26.03.12 г.
Получены трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие ген PnEXPA3, кодирующего а-экспансин тополя черного (Populus nigra). Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров клеток эпидермиса и мезофилла листьев, однако величина листьев оставалась в пределах нормы. Сверхэкспрессия гена PnEXPA3 стимулировала лишь рост стебля в длину, остальные морфологические параметры трансгенных растений остались практически неизменными.
Ключевые слова: экспансины, клеточное растяжение, величина органов, PnEXPA3, сверхэкспрессия, трансгенные растения, Nicotiana tabacum, Populus nigra.
DOI: 10.7868/S047514501303004X
ВВЕДЕНИЕ
Клеточное растяжение в растениях сопровождается поглощением воды центральной вакуолей и стимулируется подкислением клеточной стенки (Rayle, Cleland, 1992). Исследование процессов "кислого роста" привело к открытию новой группы белков экспансинов, опосредующих рН-зави-симое растяжение клеточных стенок (McQueen-Mason et al., 1992). Экспансины делятся на четыре семейства: экспансины А (ЕХРА), или а-экспан-сины; экспансины В (ЕХРВ), или Р-экспансины; экспансин-подобные белки A (EXLA); экспансин-подобные белки В (EXLB) (Sampedro, Cosgrove, 2005). Экспансины — эволюционно консервативные белки и в целом, аминокислотные последовательности разных а-экспансинов идентичны на 60—90% (Cosgrove, 1998). Показано, что экспансины не обладают ферментативной активностью, но принимают участие в разрыве нековалентных связей между целлюлозными микрофибриллами и гликановыми поперечными мостиками (см. обзор Шаровой, 2007). Действуют они в матриксе, судя по всему, совместно с трансгликозилазами, катализирующими процессы переноса и удлинения гликановых цепей и эндоглюканазами, обладающими способностью разрывать цепи гемицеллю-
лоз (Fry et al., 1992). Благодаря способности ослаблять жесткость клеточной стенки экспансины принимают участие во всех ростовых процессах растений (Azeez et al., 2010; Park et al., 2010), причем экспрессия экспансинов регулируется почти всеми известными фитогормонами (Lee et al., 2001). В каждом растении присутствуют большое количество разнообразных экспансинов, но лишь у немногих растений они идентифицированы и определены их функции. Например, в араби-допсисе было обнаружено 26 генов а-экспансинов и пять в-экспансинов, в геноме риса — 26 генов а-и 14 генов в-экспансинов (Cosgrove et al., 1997).
Особый интерес представляет изучение экс-пансинов древесных растений, так как они могут быть применены в лесной биотехнологии для создания новых пород деревьев с увеличенным размером ствола. Из древесных растений одним из первых был секвенирован геном тополя Populus tri-chocarpa, поэтому поиск и изучение экспансинов у этого растения не представляет трудностей. Древесина формируется в процессе вторичного роста в результате активности клеток камбия. В камбиальной зоне гибридной осины (Populus tremula L. х х P. tremuloides Michx.) наибольший уровень экспрессии был характерен для трех генов а-экспан-
синов (PttEXPA1, PttEXPA2 и PttEXPA8) и одного Р-экспансина (PttEXPB1) (Gray-Mitsumune et al., 2004), при этом в количественном отношении больше всего было мРНК гена PttEXPA1, что говорит об активном участии данного экспансина в процессах вторичного роста у древесных растений. В древесине напряжения наибольший уровень экспрессии был характерен для экспансина PttEXPA5 (Gray-Mitsumune et al., 2004). В молодых листьях обнаруживалась экспрессия генов PttEXPA2, PttEXPA3, PttEXPA4 и PttEXPA6, причем больше всего было мРНК гена PttEXPA3.
Одним из эффективных методов изучения экс-пансинов является получение трансгенных форм с повышенным или пониженным уровнем экспрессии целевых генов и проведение морфофизиоло-гического анализа опытных растений в сравнении с контрольными (Cho, Cosgrove, 2000). К тому же манипуляция с уровнем экспрессии различных экспансинов может стать одним из эффективных методов получения трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Действительно, трансгенные по гену AtEXPA10 растения араби-допсиса характеризовались увеличением длины черешков и площади листовой пластинки (Cho, Cosgrove, 2000). Эктопическая экспрессия гена PttEXPA1 способствовала увеличению размеров междоузлий и площади листьев у трансгенной осины (Gray-Mitsumune et al., 2008). В литературе имеются также сведения о негативном влиянии сверхэкспрессии экспансинов на рост растений (Гао и др., 2010).
В данной работе описываются эксперименты по выделению гена PnEXPA3 тополя черного (Pop-ulus nigra) и получения на основе этого гена трансгенных растений табака с целью изучения влияния его эктопической экспрессии на величину органов и размеры отдельных клеток. Исходя из литературных данных (Gray-Mitsumune et al., 2004), предполагалось, что трансгенные по гену PnEXPA3 растения табака будут, в первую очередь, отличаться увеличенными размерами листьев.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции
В работе использованы бактерии E. coli штамма XL1-Blue и A. tumefaciens штамма AGL0. Из плаз-мид использовали Т-вектор pKRX и бинарные векторы pCambia 1301 и pCambia 1305.1 с геном
устойчивости к гигромицину и репортерным геном GUS (CAMBIA, Австралия). Геномную ДНК табака выделяли методом солевой экстракции. Тотальную РНК выделяли тризолом фирмы Invitro-gen (США). ОТ-ПЦР осуществляли при помощи MuLV-обратной транскриптазы (Fermentas, Литва). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний используя наборы фирмы Цитокин (Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI (BioRad, США). Ген PnEXPA3 выделили из тотальной ДНК табака при помощи праймеров PnEXPF AATCTTCCTGAAAATGGCTC и PnEXPR ACG-GTCCCTAACGAAACTGG. Для ОТ-ПЦР гена PnEXPA3 использовали праймеры GTGCGT-GAATGACCCGAAATGG и CTGTGAACCTTAT-GCCTCCTCTCC. Для получения ампликонов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-поли-меразу (Сибэнзим, Россия), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-полимеразу (Сибэн-зим, Россия). Для поиска целевых клонов при ли-гировании в векторе pCambia 1301 использовали праймер 35SCambF: AGAGGACCTAACA-GAACTCG в паре с праймером 1301R TGCTCTAGCATTCGCCATTC. Секвенирование проводили на автоматическомсеквенаторе 'ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, США). Электропорацию компетентных клеток A. tumefaciens проводили при помощи электропо-ратора фирмы Bio-Rad модели Micropulser. Поиск гомологичных генов осуществляли при помощи программы MegAlign пакета Lasergene (DNASTAR, США) и программы MegaBlast, доступной через сайт http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Получение трансгенных растений табака,
морфологическая характеристика и условия выращивания растений
Трансгенные формы табака (Nicotiana taba-cum L. Petit Havana SR-1) получали методом агро-бактериальной трансформации листовых дисков (Кулуев и др., 2012). Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л НУК), содержащей 25 мг/л гигромицина (Hyg). Качественную оценку активности репортерного
гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гисто-химически, используя субстрат X-Gluc (натриевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета^-глюкуро-новой кислоты). Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л Hyg, затем переносили в почвенную смесь, акклиматизировали к условиям почвы, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство). Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии проращивали на среде MC с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через 3 недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев, определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера и выделяли для дальнейшей работы линии с одной интегрированной копией трансгенов.
Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом ("Гера", Россия) на открытой светопло-щадке при температуре 25—27°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 клк. Наблюдение за растениями поколения Т1 осуществляли начиная от стадии появления корешков до получения семян, что занимало от 4 до 6-ти месяцев. Замеры величины листьев производили только после пересадки в почву, через каждые 30, 45 дней и в период цветения, в итоге было осуществлено 3 замера. По каждому варианту (линия трансгенных растений) было отобрано по 5 растений, измеряли по три самых крупных нижних листа в длину, начиная от начала листовой пластины, по центральной жилке до самого кончика. Затем вычисляли среднее значение длины листа для каждого растения. Измерения длины стебля и цветков проводили в период цветения. Определяли площадь 3-х самых крупных нижних листьев и вычисляли среднее значение. Для изучения влияния конститутивной экспрессии целевого гена на размер и количество клеток, проводили измерения площади клеток нижнего эпидермиса листьев одного возраста. Эпидермис снимали с основания и середины листа. Определяли среднее число клеток, приходящихся на один лист и на 1 мм2 листовой поверхности. Измерения проводили при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия) с использованием оригинального программного
обеспечения. Для оценки размеров клеток мезофилла листа делали его гистологические срезы в трех уча
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.