научная статья по теме МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН PNEXPA3 ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО Биология

Текст научной статьи на тему «МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН PNEXPA3 ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО»

ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 3, с. 166-173

= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1:577.214.625:578.853

МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН PnEXPA3 ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО © 2013 г. Б. Р. Кулуев, М. Г. Сафиуллина, А. В. Князев, А. В. Чемерис

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, ул. Проспект Октября, д. 71 E-mail: kuluev@bk.ru Поступила в редакцию 13.02.12 г. Окончательный вариант получен 26.03.12 г.

Получены трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие ген PnEXPA3, кодирующего а-экспансин тополя черного (Populus nigra). Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров клеток эпидермиса и мезофилла листьев, однако величина листьев оставалась в пределах нормы. Сверхэкспрессия гена PnEXPA3 стимулировала лишь рост стебля в длину, остальные морфологические параметры трансгенных растений остались практически неизменными.

Ключевые слова: экспансины, клеточное растяжение, величина органов, PnEXPA3, сверхэкспрессия, трансгенные растения, Nicotiana tabacum, Populus nigra.

DOI: 10.7868/S047514501303004X

ВВЕДЕНИЕ

Клеточное растяжение в растениях сопровождается поглощением воды центральной вакуолей и стимулируется подкислением клеточной стенки (Rayle, Cleland, 1992). Исследование процессов "кислого роста" привело к открытию новой группы белков экспансинов, опосредующих рН-зави-симое растяжение клеточных стенок (McQueen-Mason et al., 1992). Экспансины делятся на четыре семейства: экспансины А (ЕХРА), или а-экспан-сины; экспансины В (ЕХРВ), или Р-экспансины; экспансин-подобные белки A (EXLA); экспансин-подобные белки В (EXLB) (Sampedro, Cosgrove, 2005). Экспансины — эволюционно консервативные белки и в целом, аминокислотные последовательности разных а-экспансинов идентичны на 60—90% (Cosgrove, 1998). Показано, что экспансины не обладают ферментативной активностью, но принимают участие в разрыве нековалентных связей между целлюлозными микрофибриллами и гликановыми поперечными мостиками (см. обзор Шаровой, 2007). Действуют они в матриксе, судя по всему, совместно с трансгликозилазами, катализирующими процессы переноса и удлинения гликановых цепей и эндоглюканазами, обладающими способностью разрывать цепи гемицеллю-

лоз (Fry et al., 1992). Благодаря способности ослаблять жесткость клеточной стенки экспансины принимают участие во всех ростовых процессах растений (Azeez et al., 2010; Park et al., 2010), причем экспрессия экспансинов регулируется почти всеми известными фитогормонами (Lee et al., 2001). В каждом растении присутствуют большое количество разнообразных экспансинов, но лишь у немногих растений они идентифицированы и определены их функции. Например, в араби-допсисе было обнаружено 26 генов а-экспансинов и пять в-экспансинов, в геноме риса — 26 генов а-и 14 генов в-экспансинов (Cosgrove et al., 1997).

Особый интерес представляет изучение экс-пансинов древесных растений, так как они могут быть применены в лесной биотехнологии для создания новых пород деревьев с увеличенным размером ствола. Из древесных растений одним из первых был секвенирован геном тополя Populus tri-chocarpa, поэтому поиск и изучение экспансинов у этого растения не представляет трудностей. Древесина формируется в процессе вторичного роста в результате активности клеток камбия. В камбиальной зоне гибридной осины (Populus tremula L. х х P. tremuloides Michx.) наибольший уровень экспрессии был характерен для трех генов а-экспан-

синов (PttEXPA1, PttEXPA2 и PttEXPA8) и одного Р-экспансина (PttEXPB1) (Gray-Mitsumune et al., 2004), при этом в количественном отношении больше всего было мРНК гена PttEXPA1, что говорит об активном участии данного экспансина в процессах вторичного роста у древесных растений. В древесине напряжения наибольший уровень экспрессии был характерен для экспансина PttEXPA5 (Gray-Mitsumune et al., 2004). В молодых листьях обнаруживалась экспрессия генов PttEXPA2, PttEXPA3, PttEXPA4 и PttEXPA6, причем больше всего было мРНК гена PttEXPA3.

Одним из эффективных методов изучения экс-пансинов является получение трансгенных форм с повышенным или пониженным уровнем экспрессии целевых генов и проведение морфофизиоло-гического анализа опытных растений в сравнении с контрольными (Cho, Cosgrove, 2000). К тому же манипуляция с уровнем экспрессии различных экспансинов может стать одним из эффективных методов получения трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Действительно, трансгенные по гену AtEXPA10 растения араби-допсиса характеризовались увеличением длины черешков и площади листовой пластинки (Cho, Cosgrove, 2000). Эктопическая экспрессия гена PttEXPA1 способствовала увеличению размеров междоузлий и площади листьев у трансгенной осины (Gray-Mitsumune et al., 2008). В литературе имеются также сведения о негативном влиянии сверхэкспрессии экспансинов на рост растений (Гао и др., 2010).

В данной работе описываются эксперименты по выделению гена PnEXPA3 тополя черного (Pop-ulus nigra) и получения на основе этого гена трансгенных растений табака с целью изучения влияния его эктопической экспрессии на величину органов и размеры отдельных клеток. Исходя из литературных данных (Gray-Mitsumune et al., 2004), предполагалось, что трансгенные по гену PnEXPA3 растения табака будут, в первую очередь, отличаться увеличенными размерами листьев.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции

В работе использованы бактерии E. coli штамма XL1-Blue и A. tumefaciens штамма AGL0. Из плаз-мид использовали Т-вектор pKRX и бинарные векторы pCambia 1301 и pCambia 1305.1 с геном

устойчивости к гигромицину и репортерным геном GUS (CAMBIA, Австралия). Геномную ДНК табака выделяли методом солевой экстракции. Тотальную РНК выделяли тризолом фирмы Invitro-gen (США). ОТ-ПЦР осуществляли при помощи MuLV-обратной транскриптазы (Fermentas, Литва). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний используя наборы фирмы Цитокин (Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI (BioRad, США). Ген PnEXPA3 выделили из тотальной ДНК табака при помощи праймеров PnEXPF AATCTTCCTGAAAATGGCTC и PnEXPR ACG-GTCCCTAACGAAACTGG. Для ОТ-ПЦР гена PnEXPA3 использовали праймеры GTGCGT-GAATGACCCGAAATGG и CTGTGAACCTTAT-GCCTCCTCTCC. Для получения ампликонов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-поли-меразу (Сибэнзим, Россия), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-полимеразу (Сибэн-зим, Россия). Для поиска целевых клонов при ли-гировании в векторе pCambia 1301 использовали праймер 35SCambF: AGAGGACCTAACA-GAACTCG в паре с праймером 1301R TGCTCTAGCATTCGCCATTC. Секвенирование проводили на автоматическомсеквенаторе 'ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, США). Электропорацию компетентных клеток A. tumefaciens проводили при помощи электропо-ратора фирмы Bio-Rad модели Micropulser. Поиск гомологичных генов осуществляли при помощи программы MegAlign пакета Lasergene (DNASTAR, США) и программы MegaBlast, доступной через сайт http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Получение трансгенных растений табака,

морфологическая характеристика и условия выращивания растений

Трансгенные формы табака (Nicotiana taba-cum L. Petit Havana SR-1) получали методом агро-бактериальной трансформации листовых дисков (Кулуев и др., 2012). Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л НУК), содержащей 25 мг/л гигромицина (Hyg). Качественную оценку активности репортерного

гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гисто-химически, используя субстрат X-Gluc (натриевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета^-глюкуро-новой кислоты). Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л Hyg, затем переносили в почвенную смесь, акклиматизировали к условиям почвы, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство). Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии проращивали на среде MC с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через 3 недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев, определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера и выделяли для дальнейшей работы линии с одной интегрированной копией трансгенов.

Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом ("Гера", Россия) на открытой светопло-щадке при температуре 25—27°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 клк. Наблюдение за растениями поколения Т1 осуществляли начиная от стадии появления корешков до получения семян, что занимало от 4 до 6-ти месяцев. Замеры величины листьев производили только после пересадки в почву, через каждые 30, 45 дней и в период цветения, в итоге было осуществлено 3 замера. По каждому варианту (линия трансгенных растений) было отобрано по 5 растений, измеряли по три самых крупных нижних листа в длину, начиная от начала листовой пластины, по центральной жилке до самого кончика. Затем вычисляли среднее значение длины листа для каждого растения. Измерения длины стебля и цветков проводили в период цветения. Определяли площадь 3-х самых крупных нижних листьев и вычисляли среднее значение. Для изучения влияния конститутивной экспрессии целевого гена на размер и количество клеток, проводили измерения площади клеток нижнего эпидермиса листьев одного возраста. Эпидермис снимали с основания и середины листа. Определяли среднее число клеток, приходящихся на один лист и на 1 мм2 листовой поверхности. Измерения проводили при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия) с использованием оригинального программного

обеспечения. Для оценки размеров клеток мезофилла листа делали его гистологические срезы в трех уча

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»